pluripotent stem cell Modeling

سلام سلام سلام….سلام به همه ی همراهان سایت نت سای…
بعد از چند روز صحبت در مورد پروتکل تکنیک های رایج ازمایشگاهی امروز می خوایم به در خواست بعضی از شما عزیزان راجه به یک مطلب اموزشی مهم در علم ژنتیک و سلولی مولکولی صحبت کنیم…
اما قبلش چند تا سوال در مورد موضوعی که میخوام راجع بهش باهاتون حرف بزنم دارم ..

 تا حالا چیزی از مدل سازی بیماری های انسانی شنیدین؟؟؟ میدونین به چه دردی میخورن؟؟
از روش های in vitro برای مدل سازی چیزی شنیدین؟؟؟
انواع سلول های pluripotent stem cell رو میشناسین؟؟؟
میدونین cellular Reprogramming چیه؟؟؟
از مدل سازی isogenic برای بیماری های انسانی چیزی شنیدین؟؟؟

امروز در نت سای قصد داریم در این زمینه ها با هم صحبت کنیم…
هدف اینه که در اخر مطلب شما قادر به پاسخگویی تمام سوالات بالا باشین… پس با ما همراه باشین

 مدل سازی تجربی بررسی انواع اختلالات انسانی ، شناسایی و ایجاد تعریف درست از مکانیسم های سلولی و مولکولی و انالیز پیشرفت مراحل درمانی را در بیماری ها امکانپذیر می سازد..
به عنوان پایه ی مولکولی بسیاری از بیماری ها میتواند شناخت درستی از جایگاه بیماری ایجاد کند.
مدل سازی بیماری ها از طریق مطالعه ی ژنئتیپ اختصاصی در بستر ازمایشگاهی مناسب ایجاد می شود.
بسیاری از اطلاعاتی که امروز در مورد عملکرد بیماری و نقش ژن های خاص در بروز انها داریم از طریق مطالعه بر روی مدل های بیماری ایجاد میشوند..

 پس با ویژگی هایی که در بالا در مورد نقش مدل های بیماری در مطالعه پیدایش و درمان انها ذکر کردیم اهمیت ایجاد این مدل ها بیش از پیش بر ما اشکار میشود..

در ابتدا در زمینه ی مدل سازی از مدل های حیوانی برای شبیه سازی بیماری ها استفاده می کردند..که اندیشه ی پایه ی ان شباهت و همانند سازی بین مدل های حیوانی با انسان بود…
اهمیت و اعتبار و کارامدی این نوع مدل سازی بستگی به انتخاب درست مدل حیوانی دارد.دانش درست از اناتومی و فیزیولوژی دقیق مدل ها کمک شایانی در پیشرفت استفاده از ان نموده است…

آنواع متنوعی از مدل های حیوانی برای شبیه سازی بیماری های انسانی وجود دارد اما در این مطلب ما به انها اشاره ای نمیکنیم چون هدف این مطلب بررسی مدل های in vitro و ازمایشگاهی است…

انواع مدل های حیوانی مورد استفاده

انواع مدل های حیوانی مورد استفاده

با توجه به محدودیت های استفاده از مدل های حیوانی در سطوح مختلفی از جمله ژنومی ، فیزیولوژیکی استفاده از حیوانات به عنوان مدل امروزه بسیار کم شده است…

به عنوان مثال یک ژنوتیپ مشخص در یک گونه میتواند کشنده و در گونه ی دیگر زیست پذید باشد مثلا موش با مونوزومی X زنده میماند اما همین نوع انیوپلوییدی در انسان کسشنده است و از طرف دیگر جهش در ژن بلوم در ژنوم انسان منجر به سندروم بلوم شده که نوعی ناپایداری ژنومی ست که ایجاد سرطان میکند اما در ژن اورتولوگ موشی همین جهش منجر به کمرگ می شود.

از طرفی بسیاری از واریانت های ژنتیکی مربوط به بیماری های انسانی در ناحیه ی غیر کد کننده ی ژنوم وجود دارند که از لحاظ تکاملی کمتر حفظ شده اند پس معرفی این نوع واریانت ها به حیوان غیرممکن است که فنوتیپی مسابه با بیماری انسانی تولید کند.

خوب قانع شدین که چرا برای شبیه سازی انواع بیماری های انسانی نمیتونیم از مدل های حیوانی استفاده کنیم؟؟؟
پس چیکار کنیم جه طوری بیماری ها رو شبیه سازی کنیم؟؟؟ و مراحل پیشرفت و درمان رو در انها بررسی کنیم؟؟؟
جواب اینجاست پیشرفت های اخیر در زمینه ی Reprogramming سلول دروازه ی جدیدی را در عصر نوین مدل سازی بیماری ها گشود…

برای توضیح این مدل از مدل سازی ها باید اصطلاح زیر و به خوبی بشناسیم
سلول های بنیادی پرتوان (Pluripotent stem cell): این مدل از سلول ها از انواع نادر اما طبیعی در مراحل اولیه ی جنینی هستند که علاوه بر قابلیت خود‏نوزایی نامحدود، دارای توانایی تمایزی بالایی به دودمان‏های سلولی مختلف هستند که به این قابلیت، پرتوانی می‌گویند.
پس این سلول ها توانایی گسترش و تمایز برای تولید منبع نا محدودی از رده های سلولی بیمار را دارند که می تواند به عنوان ابزاری برای ارتقای دانش مکانیسم ایجاد بیماری و ازمایش روش های مختلف درمان استفاده شود.

پس PSC ها با سه ویژگی زیر توانایی عملکرد بهتری نسبت به مدل سازی حیوانی دارند…
۱- سلول های بنیادی پرتوان همان رده های سلولی اولیه طبیعی هستند.
۲- توانایی ذاتی برای خودزایی نامحدود دارند.
۳- توانایی تبدیل شدن به انواع مختلف سلول و بافت را از طریق تمایز دارند.

حالا میخوام بهتون بگم مدل های بر پایه ی PSC ها چطوری میتونن برای بررسی اختلالات ژنتیکی استفاده بشن؟؟؟
جواب این سوال استفاده از سلول های بنیادی جهش یافته است… که میتواند از طرق زیر مشتق شود:
۱- دستکاری ژنتیکی سلول های بنیادی پرتوان طبیعی جنینی
۲- از سلول های جنینی بیمار از طریق روش preimplantation genetic giagnosis(PGD)
۳- از طریق ایجاد Reprogramming سلول های سوماتیکی بیماران بالغ

یکمی پیجیده شد فکر کنم خوب متوجه نشدین پس بیاین برای درک بهتر ابتدا انواع سلول های بنیادی پرتوان رو با هم بررسی کنیم…
سه مدل سلول بنیادی پرتوان داریم:
۱- سلول های بنیادی پرتوان جنینی: این سلول ها انواع PSC های طبیعی هستند که از لول های بلاستوسیت مشتق میشوند و قابلیت خود نوزایی (Self renewal) دارند و از طرفی میتوانند به انواع مختلف سلول و بافت تمایز یابند.
بر این اساس این مدل سلول چند توان یک فرصت منحصر به فرد برای مطالعه ی مکانیسم های بنیادی و روند های ککنترلی تعیین کننده سرنوشت سلول در حین تکوین اولیه جنین را فراهم میکند.

نمایی از سلول های نیادی جنینی و تمایز انها

نمایی از سلول های نیادی جنینی و تمایز انها

– سلول های بنیادی پرتوان القا شده (Induced Plutipotent Srem Cell) :این سلول ها بر خلاف سلول های جنینی سلول های بالغی هستند که از لحاظ ژنتیکی Reprogram شده و شبیه سلول های بنیادی پرتوان جنینی می شوند. این تغییر به واسطه ی بیان ژن ها و فاکتور های لازم برای Reprogram شدن و بیان ژن های لازم برای حفظ خصوصیات سلول های بنیادی جنینی ایجاد می شود.
دقت کردین این مدل سلول ها از سلول های بالغ مشتق میشوند . پس مزیت بالای iPSC ها در مشتق شدن انها از سلول های بیمار با فنوتیپ قابل مشاهده می باشد حتی زمانی که این بیماری دارای چندین جهش ژنتیکی مشارکت کننده می باشد.

– سلول های بنیادی مشتق شده به واسطخ ی انتقال هسته ی سلول های سوماتیکی (Stem cells derived by somatic cell nuclear transfer ) : این سلول ها به واسطه ی انتقال هسته از سلول های تمایز یافته به تخمک بدون هسته ایجاد می شود.

سلول های بنیادی مشتق شده به واسطخ ی انتقال هسته ی سلول های سوماتیکی

خوب میدونم که الان اکثرتون ازم میپرسین Cellular Reprograming یعنی چی؟؟؟
ببینین خیلی ساده است: در حالت طبیعی یکسری فاکتور های رونویسی مشهور به نام های ،oct4 nanog ،sox2 ، c-myc و kif4 هستند که برای حفظ حالت پرتوانی سلول ( یعنی توانایی تمایز به انواع مختلف سلول ها) و خودزایشی سلول های بنیادی جنینی ضروری اند منظورم اینه که این فاکتور ها هستند که با بیانشون باعث میشن که سلول های بنیادی جنینی ویژگی پرتوانی و خودزایشی پیدا کنند.

حالا فکر کنین چی میشه اگر ما این فاکتور ها رو خودمون به یک سلول تمایز یافته القا کنیم؟؟؟ اینکار رو در سال ۲۰۰۶ اقایان تاکاشی و یاماناکا انجام دادند یعنی اومدن سلول های سوماتیکی فیبروبلاست موش رو از طریق بیان بالای این فاکتور های رونویسی ذکر شده به سلول های بنیادی پرتوان القایی تبدیل کردند بخاطر همین از اون موقع به این فاکتور های رونویسی فاکتور ها ی یاماناکا میگن…

خوب حالا بنظرتون این فاکتور ها رو چه طوری به سلول القا کردن؟؟؟؟
دو روش برای reprogram کردن سلول ها و وارد کردن فاکتور های رونویسی یاماناکا وجود داره:
۱- متد های بر پایه Trangnenic
۲- متد های بر پایه ی راه هایی به غیر از Transgenic مثل استفاده از پروتئین های انتقال دهنده ، Transposon ها و یا miRNA ها و ….

حالا که انواع سلول های بنیادی پرتوان رو شناختیم میخوایم یاد بگیریم که چطوری میتونیم از سلول های بنیادی پرتوان القایی( iPSCها) برای مدل سازی استفاده کنیم…
ببینین روش ایجاد سلول های iPSC اینجوریه که ابتدا بخشی از سلول فرد بیمار را بیوپسی میکنیم بعدش انها رو با کمک متد های گفته شده Reprogram میکنیم .
بافت های اختصاصی مربوط به بیماری می تواند برای پیشرفت فهم بهتر بیماری و مکانیسم ایجاد ان و همچنین یافتن راهکاری برای درمان مورد استفاده قرار بگیرد.

القای پرتوانی راهی برای گسترش نامحدود جمعیت سلول ها بزای مدل سازی می باشد.

فقط یادتون باشه که اعتبار سنجی از مراحل مهم در راستای موفقیت در این مسیر است… شش مرحله ی کلیدی برای اعتبار سنجی در این مسیر وجود دارد:
۱- بافت استخراج شده از فرد بیمار باید صفات ژنتیکی بیماری را نشان دهد.
۲- مرحله ی reprogram شدن سلول ها مه نشاندهنده ی پرتوانی سلول ها است باید طی مراحل سخت اعتبار سنجی استاندارد انجام گیرد.
۳- تمایز یافتن سلول ها که نشاندهنده ی ویژگی های گلیدی سلول های بالغ است باید به واسطه ی مارکر های بیانی و کارامد ایجاد شود.

۴- سلول های تمایز یافته باید فنوتیپ بیماری را نشان دهند.
۵- تغییرات ژنتیکی و دارو های احتمالی باید قادر یه اصلاح فنوتیپ بیماری باشند. سلول های مدل شده باید بتواند پاسخ به درمان را پیشگویی کند.
۶- استفاده ی دارو برای بیمار پس از بررسی های کلینیکالی می باشد.

حالا جالبه بدونین که از iPSC ها در پزشکی هم استفاده میشه چطوری؟؟؟
در دو مسیر:
۱- در مواردی که جهش ایجاد کننده ی بیماری شناخته شده باشد با استفاده از روش های Gene Targeting میتوان توالی DNA مورد نظر را اصلاح نمود.سپس iPSC دارای DNA ی اصلاح شده رو به بافت مورد نظر تمایز داد و به فرد بیمار تزریق کرد.
۲- راه دیگر تمایز مستقیم iPSC ها به بافت بیماری مورد نظر و استفاده از ان به عنوان مدل بیماری in vitro برای غربالگری دارویی و کشف ترکیبات درمانی جدید می باشد.

راه های استفاده از iPSC ها در موارد پزشکی

یک نکته ی خیلی مهم که حتما باید در نظر داشته باشیم این است که iPSC ها همواره خاطرات اپی ژنتیکی خود را از منشا اولیه ی سوماتیکی خود حفظ یکنند که این مسئله نقش مهمی در قابلیت iPSC ها در تمایزشان به انواع مختلف سلولی دارد.
پس همیشه باید منبع سلول سوماتیکی با نوع سلولی که باید مدل خاص بیماری شود تطابق داشته باشد. مثلا iPSC های منشا گرفته از پروستات یا مجاری ادراری در مقایسه با iPSC های مشتق شده از فیبرئبلاست های پوست قابلیت بهتری برای تمایز به سلول های پروستات و مجاری ادراری دارند.
این امر نشان دهنده ی تفاوت های اپی ژنتیکی بین انواع سلول ها است و نشان می دهد که منشا نوع سلول نقش کلیدی در کارایی تمایزات هدفمند دارد.

خوب حالا که از ویژگی های سلول های iPSC در مدل سازی بیماری ها گفتیم بیاین کمی هم در مورد مشکلات کار با iPSC های خاص یک بیماری صحبت کنیم
بی ثباتی و ناپایداری کلونی که از طریق فاکتور های متنوعی در طی روند Reprogramming ایجاد میشود در کنار بالا رفتن تعداد پاساژ های iPSC و شرایط محیط کشت می تواند بر روی سطح اپی ژنتیکی کلون های iPSC تاثیر بگذارد.

در مدل سازی بیماری های sporadic مثل الزایمر مطالعات in vitro عموما تغییرات نامحسوسی را بین مدل سلولی بیماری و سلول های کنترلی نشان میدهد که گویای این مطلب است که تغییرات خاص ژنتیکی بین افراد مختلف ممکن است به عنوان یک تغییر دهنده ی ژنتیکی عمل کند و بر روی قابلیت بیماری زایی ان تاثیر بگذارد. پس باید هرگونه تغییرات ژنتیکی اضافه بین مدل سلولی بیماری و مدل سلولی منترلی را از بین برد تا مقایسه و انالیز های مولکولی دقیق تری از مدل سازی بیماری داشته باشم…

ببینید وقتی نمونه کنترل و بیمار از اشخاص مختلف گرفته شود یکسری تفاوت های ژنتیکی فردی در انالیز های مقایسه ای تاثیر میگذارد پس باید این تفاوت های فردی از انالیز ها حذف شود.ببینید وقتی نمونه کنترل و بیمار از اشخاص مختلف گرفته شود یکسری تفاوت های ژنتیکی فردی در انالیز های مقایسه ای تاثیر میگذارد پس باید این تفاوت های فردی از انالیز ها حذف شود.

خوب پیشنهادتون برای حذف این تفاوت های فردی بین افراد کنترل و بیمار چیه؟؟؟
جوابش استفاده از مدل سازی بیماری های انسانی با جمعیت سلول های isogenic هست.
این مدل ها جمعیتی از سلول های iPSC هستند که انتخاب شدن و از طریق تکنیک هایی مثل مهندسی ژنتیک ( در روز های قبل انواع این تکنیک ها را توضیح دادیم) در جایگاه خاص ژنی تغییر کرده اند تا بتوانند مدل یک بیماری خاص در شرایط in vitro باشند.
خوب متوجه نشدین؟؟؟
ببینین هدف ما کم کردن هر گونه تفاوت ژنتیکی در نمونه سلول کنترلی و بیماره تا فقط عامل مولد بیماری تفاوت بین این دو باشه… پس باید جمعیت های سلولی را انتخاب کنیم که از یک منشا باشند و ما با استفاده از تکتیک های مهندسی ژن از جمله ZFN و یا Crispr در جایگاه خاصی که مولد بیماری است جهش را ایجاد کنیم.

پس به این نتیجه میرسیم که با توجه به اینکه تغییرات ژنوتیپی منجر به ایجاد تغییرات فنوتیپی میشود هر گونه گوناگونی در ژنوتیپ سبب پیچیده شدن شناسایی فتوتیپ خاصی نیشود که با ژنوتیپ بیماری زا در ارتباط است…
ویرایش ژنی میتواند سبب ایجاد تغییر ژنتیکی خاص در سلول سالم و تبدیل ان به سلول بیمار شود و یا بر عکس تغییر یا جهش خاص در جایگاه ژنومی مولد بیماری در سلول بیمار میتواند سلول کنترل را ایجاد کند اینجوری هر دو سلول کنترل و بیمار از یک منشا بوده و به جز ژن مولد بیماری، تفاوت ژنوتیپی دیگری که بخواهد در فنوتیپ تاثیر بگذارد ندارند…

این مزیت استفاده از سلول های isogenic نسبت به iPSC ها در مدل سازی می باشد.

مقایسه دو نوع مدل سازی استفاده از iPSC ها و Isogenic cell ها

مقایسه دو نوع مدل سازی استفاده از iPSC ها و Isogenic cell ها.

پس بیاین یک جمع بندی کلی از مدل سازی های in vitro داشته باشیم:
۱- استفاده از iPSC ها که سلول های reprogram شده ی حاصل از بیمار هستند که باید با نمونه ی کنترلی فر دیگر ( دقت کنین فرد دیگر) مقایسه ميشوند.iPSC های تمایز یافته ی فرد بیمار فنوتیپ بیماری را نشان می دهد که این فنوتیپ باید با فنوتیپ نمونه ی کنترلی فرد دیگر مقایسه گردد. با توجه به اینکه ۲ نمونه ی مورد مقایسه پیشینه ی ژنتیکی ( ژنتیکی و اپی ژنتیکی ) مشابه ندارند، مقایسه ی این دو گیج کننده خواهد بود.
۲- استفاده از سلول های Isogenic با استفاده از ویرایش ژنی با کمک روش های ZFN، TALENو Crisper می توان یک جهش بیماری زا را در یک iPSC اصلاح کرد و از ان به عنوان نمونه ی کنترل همون iPSC بیمار استفاده کرد به دلیل اینکه هر دو نمونه از یک شخص می باشدو پیشینه ی ژنتیکی دو نمونه یکسان است مقایسه ی فنوتیپ بین این دو نمودار معنادار می باشد.

حالا بیاین مزایای استفاده از مدل های isogenic رو با هم بررسی کنیم:
توانایی اصلاح iPSC های فرد بیمار و یا القای جهش خاص یک بیماری به iPSC سالم به کمک اندونوکلئاز ها یک ابزار قدرتمند را ایجاد می کند برای:
۱- برای سنجش بیماری زایی جهش های جدید
۲- برای اگاهی یافتن از روند مکانیسم بیماری در رده های سلولی مختلف مربوط به یک فنوتیپ فرد بیمار
۳- این راهکار اجازه ی بررسی مشارکت پیشینه ی ژنتیکی یک سلول را در ایجاد فنوتیپ یک بیماری ایجاد شده با جهش مشخص را از طریق مقایسه ی iPSC مشتق شده از بیمار یا iPSC های اصلاح شده را میدهد.

خوب حالا میرسیم به اخرین مبحث که اونهم شناسایی فنوتیپ های مربوط به بیماری است
مدل سازی بیماری های انسانی در شرایط in vitro نیازمند فنوتیپ های خاص و مربوط به بیماری دارد تا به کمک انها شناسایی شود
این فنوتیپ ها به طور کلی در سه گروه قرار می گیرند:
۱- فنوتیپ های مولکولی: شامل انالیز بیان رونوشت های RNA و پروتئین ها و مارکر های اپی ژنتیکی
فنوتیپ های مولکولی به طور اختصاصی برای شناسایی مراحل غربالگری دارویی کاربرد دارد و بصورت اتوماتیکی بررسی میشود.
۲- فنوتیپ های سلولی: شامل ناهنجاری های مرفولوژیکی ، تجمع پروتئین ها یا افزایش اپوپتوز می باشد که از رایج ترین روش های تشخیصی در بیماری های انسانی است و عموما برای مدل سازی اختلالات متابولیکی استفاده میشود.
۳- فنوتیپ های فیزیولوژیکی: از چالش برانگیزترین روش های ارزیابی هستندکه عموما در مطالعات نورولوژیکی و بیماری های قلبی استفاده میشوند .
ارزیابی این مدل فنوتیپی مربوط به اندازه گیری تبادلات یونی، فعالیت کانال ها و انفباضات می باشد.

خوب خسته نباشین.. مبحث امروز هم تموم شد… حالا اگر خوب و با دقت مطالب رو مطالعه کردین می تونین بر گردین به اول متن امروز و ببینین میتونین جواب سوالایی که مطرح کردیم و بدین؟؟؟ من مطمئنم که می تونین…

print


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

پانزده − 6 =