PCR

سلام سلام سلام…. سلام به همه ی همراهان عزیز نت سای…
خوب دیگه بعد از مدت ها که دائما با درخواست توضیح مراحل PCR از طرف شما مواجه بودم امروز قصد دارم در نت سای در مورد روش انجام PCR معمولی باهاتون صحبت کنم…
پس اگرمشتاق هستین که با مراحل انجام کار تکنیک PCR اشنا بشین با نت سای همراه باشین….

PCR

بیاین اول ببینیم PCR مخفف چیه و اصلا یعنی چی؟؟؟
واژه ی PCR مخفف Polymerase Chain Reaction به معنی واکنش زنجیره ای پلیمراز هستش.
خوب حالا بیاین بفهمیم PCR چکار میکنه و چرا انقدر مهمه؟؟
ببینین PCR تکنیکی برای تکثیر یک یا تعداد اندکی از نسخه های یک قطعه DNA به میلیونها نسخه است. یعنی حتی اگر نمونه ی شما خیلییییی ناچیز باشه باز هم میتونین با PCR قطعات ژنیتون رو زیاد کنین.
اساس کار PCR استفاده از توانایی آنزیم DNA پلیمراز برای سنتز رشته های جدید DNA است که این رشته‌‌ها همانند DNA رشته الگو هستند.

روش PCR، در حال حاضر روش معمول و در اغلب موارد ضروری در آزمایشگاههای پژوهشی پزشکی و زیستی است و برای انواع برنامه‌های کاربردی ازجمله همسانه سازی( Cloning) ، تعیین توالی DNA ، درخت ژنتیکی یا علم بررسی تکامل موجودات، تحلیل عملکرد ژن‌ها، تشخیص بیماری‌های ژنتیکی، تعیین اثرانگشت DNA (که در علوم پزشکی قانونی و تست رد ابوت استفاده می‌شود) ، و تشخیص آلودگی‌ها و عفونت‌های ویروسی مورداستفاده می‌باشد.

اساسا از PCR براي بدست آوردن اطلاعات کمي و کيفي استفاده مي کنن.
توانايي PCR معمولي در بدست آوردن اطلاعات کيفي (Qualitative) غير قابل انکار است. چطوری؟؟؟  از آنجايي که پرايمر هاي مورد استفاده در PCR اختصاصي هستند، تنها DNA مورد نظر تکثير مي شود و بدين ترتيب مقادير بسيار ناچيز از توالي مورد نظر شناسايي مي شود.
بنابراين PCR معمولي از نظر تعيين وجود يا عدم وجود توالي خاص بسيار کارا محسوب مي شود.

خوب بنظرتون PCR چطوری میتونه یک قطعه ی کوچک ژنی رو تکثیر کنه؟؟؟ مراحل انجام تکثیر قطعه در داخل دستگاه چیه؟؟؟
سه مرحله ی کلی برای تکثیر یک قطعه ی کوچک توسط تکنیک PCR وجود داره که الان هر کدوم رو جداگانه بررسی میکنیم

مراحل كلي واکنش زنجيره اي پلي مراز يا PCR :
۱- مرحله واسرشته سازي ( Denaturation) :
اين مرحله اولين مرحله معمول PCR بوده و شامل گرم کردن محيط به ميزان ۹۸-۹۴ درجه سانتيگراد به مدت ۳۰-۲۰ ثانيه است. اين عمل باعث ذوب شدن DNA (جدا شدن دو رشته DNA از همديگر) هم DNA الگو و هم پرايمر از طريق گسستن پيوندهاي هيدروژني بين نوکلئوتيدهاي دورشتهDNA ،و توليد DNAتک رشته‌اي مي‌شود.

۲- مرحله اتصال( Annealing) :
در اين مرحله دماي واکنش به ۶۵-۵۰ درجه سانتيگراد به مدت ۴۰-۲۰ ثانيه کاهش مي يابد تا امکان اتصال DNA پليمراز و پرايمر به DNAالگوي نوع تک رشته‌اي فراهم شود.

۳- مرحله گسترش يا طويل شدن ( Extension/Elongation ):
درجه حرارت اين مرحله به آنزيم پليمراز و درجه حرارت بهينه فعاليت آن بستگي دارد. بطور مثال، آنزيم Taqپليمراز در درجه حرارت ۸۰-۷۵ درجه سانتيگراد فعاليت قابل قبول دارد. در اين مرحله پليمراز نوکلئوتيدهاي مکمل را بر اساس رشته الگو از ۵’ به ۳’ در کنار هم قرار داده و در نهايت، رشته مکمل را توليد مي کند. مدت زمان اين مرحله به آنزيم پليمراز و طول رشته DNA الگو بستگي دارد.
مراحل PCR

خوب پس تا اینجای کار متوجه شدیم که در طی عمل PCR ابتدا دو رشته از هم جدا میشن بعد به کمک پرایمر هایی که مکمل یک ناحیه ی کوچک از دو انتهای ژن مورد نظر ما هستن رشته ی دوم برای هر رشته ی جدا شده به کمک انزیم پلیمراز سنتز می شود. این چرخه چندین بار یعنی حدودا ۳۰ تا ۴۰ بار تکرار میشه و با هر بار تکرار سیکل تعداد DNA دو رشته ای ما بصورت تصاعدی بالا میره…

اگر با دقت چیزایی که گفتم رو خونده باشین متوجه میشین که دو فاکتور برای انجام PCR لازمه:
۱- پرایمر ها: این مولکول های کوچک مکمل ناحیه ی خاصی از دو انتهای ژن مورد نظر ما هستند. معمولا برای PCR از دو تا پرایمر Forward و Reverse استفاده میکنیم که هر کدوم از این دو به یکی از رشته های DNA اولیه متصل می شوند تا عمل پلیمریزاسیون از انتهای ‘۳ انها اغاز شود.

جایگاه اتصال پرایمر های Forward و Reverseجایگاه اتصال پرایمر های Forward و Reverse

حتما میدونین که باید قبل از انجام PCR برای قطعه ی مورد نظرتون پرایمر های ژنی تون رو طراحی کنین…
طراحی پرایمر یک مبحث مفصله که انشاالله در فرصت مناسب مفصلا راجع بهش صحبت می کنم.

اما یکسری نکات هست که در طراحی پرایمرتون باید حتما لحاظ کنین…
۱٫ طول پرايمر بايد بين ۱۹ تا ۴۰ نوکلئوئيد (در حالت بهينه بين ۲۰ تا ۲۵ نونکلئوئيد) باشد.
۲٫ دماي هيپريداسيون پرايمرها Tm بايد بين ۵۸ تا ۶۰ درجه سانتي گراد باشد.
۳٫ درصد CG پرايمرها بايد بين ۸۰-۳۰ درصد باشد (که مقدار بهينه ۵۵-۴۵%) است.
۴٫ طول قطعه تکثيري ۱۵۰-۱۰۰ نوکلئوتيد بايد باشد يعني پرايمر معکوس ۱۵۰-۱۰۰ نوکلئوتيد پائين دست بايد انتخاب شود.
۵٫ در ۵ نوکلئوئيد انتهايي، بيش از دو نوکئوتيد C يا G وجود نداشته باشد.
۶٫ در توالي پرايمرها بيش از ۳ نوکئوتيد G پشت سر هم قرار نگرفته باشد.
۷٫ پرايمرها فاقد ساختار ثانويه، پرايمر دايمر و سنجاق سر باشد.
۸٫ اختلاف Tm پرايمرها حداکثر ۵% درجه سانتي گراد باشد.

وقتی پرایمرتون رو طراحی کردین باید با برنامه‌هاي OligoAnalyzer و Primer-Blast/ NCBI چک شوند. سایت Primer-Blast/ NCBI بهتون کمک میکنه تا متوجه بشین توالی پرایمری که طراحی کردین به کدوم واریانت های ژن مورد نظرتون متصل میشه، طولش و دمای اتصالش چقدره و به طور کلی اطلاعات مربوط به پرایمرتون رو بهتون میده…

بعد از اینکه توالی پرایمر طراحی شدتون رو با بلاست سنجیدین حالا باید توالی رو بدین شرکت های مخصوص تا براتون پرایمر ها رو سنتز کنن.
پرايمرهاي سفارشي به صورت ليوفيليزه مي باشد، پس از ذوب پرايمرها در دماي اتاق و سانتريفوژ مختصر آن‌ها، مقداري آب ديونيزه (ساخت شرکت سازنده) به پرايمرها اضافه کنین تا غلظت مناسبی از ان به دست بیاد بعدش پرايمرها در فريزر ۲۰- نگهداري کنین.

۲- خوب دومین فاکتور مهم در PCR انزیم مربوط به سنتز رشته های DNA به دنبال اتصال پرایمر هاست. این انزیم taq پلیمراز نام داره.
انزیم Taq Polimerase یک DNA پلیمراز مقاوم به حرارت است که اولین بار در سال ۱۹۷۶ توسط Chien و همکارانش از یک باکتری گرمادوست بنام Thermus aquaticus استخراج شد.
این آنزیم توانایی تحمل دمای بالا را دارد و به همین دلیل در تکنیک PCR کاربرد فراوانی یافته است؛ بنابراین بجای آنزیمDNA پلیمراز که از باکتری E.coli استخراج می‌شد و در گذشته در فرایند PCR مورد استفاده قرار می‌گرفت، از این آنزیم استفاده می‌شود.
دمای بهینه برای فعالیت آنزیم تگ پلیمراز، ۷۵ تا ۸۰ درجه سانتیگراد است. همچنین دارای نیمه عمر ۲ ساعت در ۹۲/۵ درجه سانتیگراد، ۴۰ دقیقه در ۹۵ درجه سانتیگراد و ۹ دقیقه در ۹۷/۵ درجه سانتیگراد می‌باشد. این آنزیم در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد قادر است ۱۰۰۰ جفت باز را در کمتر از ۱۰ ثانیه رونویسی کند.

حالا می رسیم به مرحله ی اصلی کارمون یعنی بررسی اینکه چه مقدار از مواد باید برای انجام PCR به ویالمون اضافه کنیم:
قبلش باید بهتون یه توضیحی بدم یادتونه با هم cDNA مون رو سنتز کردیم؟ حالا میخوایم همون cDNA رو برای PCR استفاده کنیم. چند تا نکته هست که باید در این مرحله بهش دقت کنین:
۱- برای طراحی پرایمر در RT-PCR پرایمر ها باید به صورت Exon-Exon junction طراحی شوند… در واقع اين پرايمر ها توانايي اتصال به توالي هاي DNA را نداشته و تنها به cDNA متصل مي شوند.
۲- حالا باید مقدار مشخصی از cDNA رو برداریم . مقداری که باید برداریم در کیت ها نوشته شده اما عموما ۲ug هستش. پس باید یادتون باشه که بعد از سنتز cDNA تون حتما غلظتش رو توسط نانودراپ بسنجین و طبق همون نسبت گیری ای که برای RNA بهتون گفتم میزان ul ای که باید از ویال cDNA برداریم رو محاسبه کنین.

حالا بیاین قبل از ارائه ی پروتکل انجام کار یک جمع بندی کوتاه داشته باشیم. ما تا الان برای بررسی کمی ژن های انتخابیمون RNA ی سلول های تحت تیمارمون رو استخراج کردیم، بعدش از روی RNA باید cDNA مون رو طبق Reverse Transcriptase PCR سنتز کنیم. حالا بعد از طراحی پرایمر های مربوط به ژن مورد نظرمون با برداشتم مقدار مشخصی از cDNA واکنش PCR رو در دستگاه ترموسایکلر اغاز میکنیم.

پروتکل انجام RT-PCR :
۱- cDNA 2ug
۲- Primer Forward (10 μM) 1 μl
۳- Primer Reverse (10 μM) 1ul
غلظت نهایی پرایمر هاتون برای انجام PCR باید ۰٫۲μM باشد.
۴- Taq 2x Master Mix 10 μl
۵- PCR-grade H2O
اب را اونفدر اضافه میکنیم که حجم نهايي واكنش ۲۰ μl گردد.

بعد از اضافه کردن مواد در ویال ، محتويات ويال را به خوبي مخلوط و در نهايت يک سانتريفيوژ کوتاه می کنیم. سپس براي هر کدام از ژنها بر اساس دماي ذوب پرايمرها برنامه PCR به دستگاه داده می شود.

حالا میرسیم به برنامه ی زمانی و دمایی که باید به دستگاه بدیم.
دقت کنین که هر پرایمری دمای annealing مخصوص به خودش رو داره پس ابتدا باید به کمک یک گرادیانت PCR دمای بهینه ی annealing پرایمر هاتون رو برای هر ژن در بیارین و بعد PCR اصلی رو انجام بدین.

مراحل و زمان و دمای انجام واکنش PCR

مراحل و زمان و دمای انجام واکنش PCR

حالا یک سوالی ازتون دارم مگر نه اینکه مرحله Denaturation اولیه برای جداسازی دو رشته ی DNA از همدیگره پس چرا برای cDNA که تک رشته است باز هم ما از مرحله ی اول استفاده میکنیم و دما رو بالا میبریم؟؟؟؟
یکمی فکر کنین چه اتفاقی میتونه این وسط بیوفته که ما احتیاج به واسرشته کردن توالی داشته باشیم؟
جوابش اینه  cDNA تک رشته ممکنه دچار شکل گیری ساختار های ثانویه بشه یعنی نواحی مکمل هم بر روی توالی ، روی هم بیفتن و ساختار های ثانویه ایجاد کنن از طرفی ممکنه در همون ابتدا پرایمر ها به هم متصل بشن و یا اتصالات نادرست ایجاد کنن.. ما دما رو در ابتدا بالا میبریم تا هم cDNA مون خطی بشه و هم پرایمر ها از هم جدا بشن تا خطا در انجام کارمون پایین بیادو
متوجه شدین؟؟ این سوال رو خیلی از اساتید ممکنه ازتون بپرسن پس خوبه که بلد باشین..

راستی یه موضوع رو فراموش نکنین اون هم استفاده از ژن های کنترلیه.. بیان این ژن ها در بین نمونه های تیمار و کنترلتون نباید زیاد با هم تفاوت داشته باشه پس باید روی ژۀ باند های تقریبا یکسانی ببینین. از این ژن های کنترلی housekeeping عموما برای normalize کردن داده ها و مقایسه ی نتایج استفاده میکنیم..
دقت کنین بهتره که برای هر ژن و بازه ی زمانیش یک ژن housekeeping بذارین.
اگر در مورد ژن housekeeping سوال دارین به قسمت سنتز cDNA رجوع کنین.

همونطور که میدونین روش RT-PCR بیشتر مخصوص بررسی کیفی بیان ژن هاست. یعنی با مقایسه ی باند های هر ژن بر روی ژل اگاروز بین نمونه های تیمار و کنترل در کنار ژن housekeeping میتونیم شدت بیان یک ژن هاص رو در نمونه ها با هم مقایسه کنیم.
پس در پایان مرحله ی PCR باید طبق روشی که قبلا بهتون گفتم ژل ۱٫۵ تا ۲ درصد اگاروز درست کنیم . در چاهک دوم DNA Ladder رو برای مشخص کردن اندازه ی هر باندمحصول PCR میریزیم.
در چاهک بعدی نتیجه ی PCR ژن housekeeping رو run می کنیم و در چاهک بعدی نتیجه ی PCR ژن اصلیمون رو برای نمونه ی منترل و چاهک بعدی نتیجه ی PCR برای ژن اصلی در نمونه ی تحت تیمار.
اگر برای نمونه های تیمار شدتون بازه ی زمانی دارین هم میتونین نتیجه ی PCR یک ژن خاص در هر بازه ی زمانی رو در یک چاهک run کنین.

پس اخرین مرحله ی انالیز کیفی بیان ژن هامون بعد از PCR ران کردن محصولات بر روی ژل اگاروزه.
برای اینکار پس از پایان واکنش PCR، حدود ۸ میکرولیتر از محصولات PCR رو با ۱ میکرولیتر از Loading dye Buffer خوب مخلوط می کنیم و به درون چاهک های ژل آگاروز ۲ درصد که درون تانک الکتروفورز حاوی TAE 1X است، منتقل میکنیم. حالا با برقراری اختلاف پتانسیل، نمونه ها روی ژل حرکت می کنن. برای ظاهر سازی باندها، ژل با اتیدیوم بروماید نشاندار و با استفاده از UV transluminator مشاهده میشه و تصاویر مربوطه پرینت گرفته میشود..
اگر برای ساخت ژل اگاروز سوال دارین به قسمت بررسی کمی و کیفی RNA سنتز شده برین اونجا کامل مراحل run کردن نمونه در الکتروفورز رو توضیح دادم.

خوب خسته نباشین… امیدوارم کاملا تونسته باشم شما رو به مبحث PCR مسلط کنم. اگر باز هم موردی هست که فکر میکنین بهش اشاره نکردم بگین تا اضافه کنم…

print
Tags: , , ,


۱ دیدگاه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

3 × دو =