سنتز cDNA

سلام به همه ی همراهان عزیز نت سای…
امروز قصد داریم در نت سای در مورد نحوه ی سنتز cDNA از RNA صحبت کنیم…

همانطور که همه تان میدانید برای بررسی کیفی و کمی بیان ژن های مورد نظرمون باید PCR انجام دهیم به این معنا که با طراحی پرایمر برای ژن های مورد نظرمون شدت و میزان بیان ژن مورد نظرمون رو بسنجیم برای اینکار نیاز به ساختن cDNA داریم…
مولکول cDNA یه مولکول DNA تک رشته مکمل RNA ایست که ما استخراج کردیم..این cDNA بعد ها به عنوان رشته ی الگو برای عمل PCR مورد استفاده قرار می گیرد.چرا؟؟ چون انزیم DNA polymerase ای که برای سنتز رشته های جدید در PCR استفاده میشه قادر به استفاده از RNA به عنوان الگو نمی باشد..

حواستون باشه چون cDNA از RNA بالغ ساخته میشه پس توالی ان کاملا شبیه توالی ژن اولیه ی ما نیست با توجه به اینکه در RNA بالغ توالی های مکمل اینترون( توالی از ژنوم که بیان نمیشوند) طی عمل اسپلایسینگ بریده میشوند پس cDNA ما نیز تنها توالی هایی را دارد که در ژنوم ما بیان میشوند. این ویژگی cDNA ان را خیلی برای کارهای ازمایشگاهی با ارزش میکند.

بنظرتون برای ساختن یک رشته cDNA از روی RNA ای که استخراج کردیم به چه موادی نیاز داریم؟؟؟

مهمترین ماده برای ساخت cDNA از RNA پرایمر است. پرایم ها مولکول های کوچک اغازگری هستند که با اتصال به نواحی مشخصی سبب اغاز PCR و سنتز توالی جدید از روی توالی هدف می شوند.
برای سنتز cDNA ما دو مدل پرایمر داریم که میتونیم از یکی از انها و یا هردوشون استفاده کنیم…

۱- توالی OligodT : این پرایمر ها قطعات کوچکی هستند که به انتهای Mrna استخراج شده ی ما که دارای توالی poly A می باشند متصل میشوند.
۲- توالی Random Hexamer: این توالی های کوچک شش نوکلئوتیدی هستند که به صودت تصادفی به هر جایی از RNA متصل می شوند.

حالا سوال اینجاست که چه تفاوتی بین این دو پرایمر در ساخت cDNA وجود دارد:
ببینین تفاوت خاصی نداره و شما میتونین بسته به اینکه کیتی که خریداری میکنین کدام پرایمر داراست از هر کدام استفاده کنین اما اگر میخواین خیلی دقیق باشین بذارین کمی از تفاوت هاشون رو در کار سنتز Cdna براتون بگم:
از پرایمر oligodT بیشتر در مواردی استفاده کنین که mRNA شما کامل و سالم باشد و خدایی نکرده انتهای polyA ان از بین نرفته باشد.از طرفی اگر فقط سرو کار شما با انواع mRNA ها است و نیازی به شناسایی انواع دیگری از RNA مثل rRNA ندارین از oligodT استفاده کنین…

حالا حتما میپرسین ما چه زمانی به شناسایی توالی هایی به غیر از mRNA نیاز داریم؟؟؟
زمانی که میخوایم از مولکول rRNA 18s به عنوان یک ژن کنترلی و یا houskeepimg در بررسی بیان ژن هامون استفاده کنیم در این مواقع چون پرایمر oligodT فقط mRNA ها رو به cDNA تبدیل میکنه دیگه در محصول ما cDNA مربوط به توالی ۱۸s وجود نداره پس کارمون کمی محدود میشه…
پس نتیجه میگیریم که از پرایمر Random Hexamer زمانی استفاده میکنیم که بخواهیم بیان همه ی ژن ها را تحت هر شرایط با هر ژن کنترلی انتخابیمون حتی ۱۸s بررسی کنیم.

پرایمر های سنتز cDNA

فاکتور مهم بعدی در سنتز cDNA انزیم رونوشت بردار معکوس Reverse Trannscriptase می باشد که با نام اختصاری RT نیز شناخته میشود. این انزین قابلیت سنتز مستقیم DNA از روی توالی RNA را دارد و به طور طبیعی در رتروویروس ها که دارای ژنوم RNA ای هستند یافت می شود.
بدون وجود این انزیم انجام این واکنش امکانپذیر نیست بهمین دلیل به عمل سنتز cDNA از RNA رونوشت بردازی معکوس و یا Reverse Transcription PCR می گویند.

مواد دیگری که در این سنتز به کار می اند بافر انزیم RT، نوکلئوتید ها (dNTPها) ، انزیم ریبونوکلئاز و RNAase H می باشد.

نقش RNAase H جداسازی دو رشته ی rna و cDNA از هم بعد از سنتز cDNA می باشد.

نگران نباشین در همه ی کیت های سنتزی که خریداری مي کنید تمام این موادی که گفتیم با هم در ویالی به نام master mix وجود دارد و شما نیازی نیست که جداگانه این ها را اضافه کنین.

خوب بررسی مواد لازم برای سنتز cDNA تموم شد حالا میریم سراغ انواع روش هاس سنتز و پروتکل انجام کار…
کیت های منتوعی برای سنتز cDNA وجود دارد که به صورت one step و two step هستند.
در حالت two step شما در ابتدا در یک ویال cDNA خود را سنتز میکنین و در ویال دیگری برای cDNA سنتز شده تون در راستای بررسی بیان ژن هاتون PCR معمولی میگذارین.
اما در حالت one step PCR شما همه ی کارها از مرحله ی سنتز cDNA تا بیان ژنتون رو در یک ویال انجام میدین.

اگر تعداد نمونه هاتون خیلی زیاده و کاملا به مراحل انجام کار تسلط دارین میتونین از کیت های one step استفاده کنین اما کیت های two step دقت بالاتری دارند و troubleshouting در هر مرحله راحت تر صورت میگیرد.

برای سنتز cDNA وقتی که نمونه ی RNA رو به همراه پرایمر ها و انزیم RT و mastermix روی یخ در یک ویال DNAase/RNAase Free مخلوط کردین بعد از کمی اسپین حالا باید منتقلش کنین به دستگاه PCR . برنامه ی زمانی که باید به PCR بدین بسته به نوع کیتی که استفاده می کنین متفاوته.. نگران نباشین پروتکل دمایی PCR در درون جعبه های کیت سنتز موجوده.
اما همه ی کیت ها در مرحله ی انجام PCR در دو step مشترک هستند:
۱- مرحله ی فعال کردن انزیمRT که برای ان به مدت یکساعت در دمای حدود ۴۰ درجه ( باز هم بسته به کیت و طراحی انزیم RT این دما می تواند متفاوت باشد) PCR صورت میگیرد.
۲- مرحله ی غیر فعال کردن انزیم که برای ان ویال در حدود۵ دقیقه در دمای ۸۰ -۷۰ درجه قرار می گیرد.

cDNA synthesis

خوب الان ازتون یه سوالی دارم یادتون میاد موقع یادگیری استخراج RNA بهتون گفتم مرحله استخراج خیلی مهمه؟؟؟ بنظرتون ارزشش کجا معلوم میشه؟؟؟
جواب این سوال اینجاست ببینین برای هر بار انجام سنتز cDNA ما به مقدار مشخصی از RNA نیاز داریم تا به cDNA ای با کیفیت بالا برسیم..
هر کیتی که استفاده می کنین بهتون میگه چه مقدار RNA باید استفاده کنین.. اما به طور کلی مقدار RNA ای که در اغلب مواقع استفاده میشه در حدود یک میکروگرم است. دقت کنین گفتم میکرو گرم. حالا برای بدست اوردن این مقدار RNA از مخلوط RNA ای که استخراج کردیم باید چکار کنیم؟؟؟
یکمی فکر کنین تا من جوابش رو بهتون بگم

اینجاست که کیفیت RNA ای که استخراج کردین مهم میشه… RNA ی شما باید اونقدر خوب و با کیفیت و غلطت مناسب باشه تا بتونین یک میکروگرم از اون رو در هر بار استفاده برای سنتز مصرف کنین..
با توجه به اینکه نمونه ی RNA شما محلول است شما باید به کمک یک نسبت گیری مناسب بدست بیارین که برای داشتن مخلوطی حاوی یک میکروگرم RNA باید از ویالتون چند ul بردارین…
یادتونه در مرحله ی تعیین کمیت RNA از دستگاه نانودراپ استفاده کردیم؟ اینکه مخلوط RNA استخراجی شما چند نانوگرم هست هم توسط دستگاه نانودراپ سنجیده میشه پس یادتون باشه موقع سنجش کمی RNA تون حتما غلظت ان را بنویسین…

حالا بیاین با هم یاد بگیریم چطوری این میزان rna رو از مخلوطمون برداریم؟؟؟
ببینین وقتی شما از نانودراپ استفاده میکنین در حقیقت دستگاه میزان غلظت RNA به واحد نانوگرمی رو بهتون میده که در یک میکرولیتر از RNA تون وجود داره پس با یک نسبت بستن ساده میتونین متوجه بشین که چند میکرولیتر از مخلوط RNA تون معادل یک میکروگرم RNA میشه.
چون هر میکروگرم معادل ۱۰۰۰ نانوگرمه پس فرمول ما بصورت شکل زیر در میاد..
مقدار RNA ای که باید از ویال برداریم=  ۱۰۰۰/عددی که دستگاه به ما میده که واحدش ng/ul است
پس برای بدست اوردن مقداری که باید بردارین باید عدد هزار و تقسیم بر عدد غلظتی که دستگاه به ما میده بکنیم…
تونستم خوب توضیح بدم؟؟؟ متوجه شدین؟؟
اگر باز هم سوالی در این زمینه داشتین حتما حتما ازم بپرسین چون این مرحله خیلیییییی در سنتز cDNA تون مهمه…

خوب بیاین یک مرور کلی بکنیم بعدش کیفیت cDNA ای که سنتز کردیم و با هم بررسی کنیم.
ما اومدیم مقداری معادل یک میکروگرم از RNA مون رو برداشتیم و طبق پروتکل کیتی که برای سنتز تهیه کردیم با مقادیر مشخصی که عموما ۱ug از پرایمر به همراه ۱ug انزیم RT و مقدار مشخصی master mix است در ویال DNAase/RNAase مخلوط کردیم بعدش طبق برنامه ی زمانی ای که کیت به ما میده این مخلوط رو در دستگاه ترموسایکلر PCR کردیم.
دقت کنین که اگر طبق این روش پیش برین Cdna شما تک رشته خواهد بود حالا میتونین این cDNA رو در ۲۰- به مدت طولانی نگه دارین…

کیت های متعددی برای سنتز cDNA در بازار موجوده که شما میتونین بر اساس هدف و بودجه تون یکیش رو انتخاب کنین .
از جمله رایج ترین کیت های خارجی که cDNA ی خوبی بهتون میدن میتونم به کیت های کمپانی های کیاژن، فرمنتاز، اینترون و شرکت ایرانی سیناکلون اشاره کنم..
دقت کنین پروتکل دقیق سنتز برای هر کیت متفاوته چون بسته به پرایمر طراحی شده و انزیم ساخته شده دماها، زمان ها و مقادیر میتونه با هم فرق کنه پس حتما قبل از استفاده sheet پروتکل موجود در کیت رو کامل مطالعه کنین…
اگر باز هم برای هر کیت خاص سوالی داشتین حتما با من درمیون بذارین..

خوب حالا رسیدیم به حساس ترین و پراسترس ترین مرحله ی کار که اونهم تعیین کیفیت cDNA سنتز شده مونه…

برای این منظور باید برای ژن های کنترلی یا housekeeping مون یک PCR معمولی بذاریم.
شاید الان سوال کنین ژن housekeeping یعنی چی؟؟؟
ببینین یکسری ژن ها هستن که تحت هر شرایطی در سلول بیان میشن و بیان انها تحت تاثیر هیچ ماده ای قرار نمیگیره و جز ژن های به اصطلاح خانه دار هستن. این ژن ها به ما در دو جا کمک می کنن:
۱- وقتی که میخوایم مثل الان کیفیت سننتز cDNA مون رو بسنجیم. چون این ژن ها در همه نمونه ها و تحت هر شرایطی بیان بالا و یکسانی دارن پس اگر ما کارمون رو درست انجام داده باشیم باید صد در صد در همه ی نمونه هامون بیان این ژن ها رو ببینیم.
۲- وقتی که در PCR معمولی و یا REAL TIME میخوایم بیان ژن ها رو بین نمونه ای سالم و تیمار شده با دارو با هم مقایسه کنیم این ژن ها کمک شایانی به normalized کردن داده ها و مقایسه ی نتایج میکنن. زیرا بیان این ژن ها بین نمونه های کنترل و تیمار با هم تفاوت چندانی نخواهد داشت.

حالا انشاالله وقتی که خواستم pcr رو توضیح بدم کامل در مورد راههای انتخاب و عملکرد انها توضیح خواهم داد…
از رایج ترین ژن های houskeeping در کارهای PCR میتونیم به ژن های GAPDH ، beta actin و یا ۱۸s اشاره کنیم.
فقط یادتون باشه که اگر میخواین از ژن ۱۸s استفاده کنین حتما باید از کیتی استفاده کنین که پرایمر ان random hexamer باشه تا علاوه بر mRNA ها از rRNA ها هم برای سنتز cDNA استفاده کنه.

خوب گفتیم که برای تعیین کیفیت cDNA باید براي یک ژن HOUSKEEPING یک PCR معمولی بذاریم و نتیجه ی PCR رو روی ژل اگاروز ببریم در صورت مشاهده ی باند SHARP در جایگاه طولی درست به این نتیجه میرسیم که cDNA ای که سنتز کردیم کیفیت خوبی داره و حالا میتونیم با ساختن پرایمر برای ژن های مورد مطالعه مون و با انجام PCR بیان ژن ها رو در نمونه ها بسنجیم.

خوب مطلبمون تموم شد امیدوارم که به خوبی مطلب امروز رو متوجه شده باشین باز هم اگر سوالی داشتین حتما حتما ازم بپرسین…
یادتون باشه که ما در کانال نت سای همیشه در تک تک مراحل ازمایشگاهی در کنارتان هستیم…

print
Tags: ,


۱ دیدگاه

  • ملیحه says:

    باسلام و تشکر از توضیحات تون خیلی خوب ساده و قابل فهم برای من که اولین بار میخوام با این کیت کار کنم توضیح دادین

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

9 − 7 =