تکنیک های رایج در ازمایشگاه کشت سلول

قراره به زودي كار هاي سلولي تون رو اغاز كنين؟؟از تكنيك هاي ازمايشگاهي كار با سلول آگاهي ندارين؟؟مي خواين موقع ورود به اتاق كشت اعتماد به نفس داشته باشين و كارهاتون رو مستقل انجام بدين؟؟؟اگر جوابتون به اين سوال ها مثبته در ادامه با ما همراه باشين…

اولین قدم در کار با سلول درست کردن محیط کشت های سلولیه که رایج ترین انها محیط های DMEM و RPMI است.. در قسمت پروتکل ها نحوه ی ساخت محیط کشت سلول رو براتون گذاشتم…

خوب لازمه اگاه باشین که محیط کشت تنها محلولی نیست که در کار سلولی با اون سرو کار دارین…محلول مهم بعدیی بافر Phosphate Buffer Saline با نام اختصاری PBS هستش که خدا رو شکر لازم نیست درستش کنین و به صورت استریل از شرکت ها می خرین… اسمش رو در کار سلولی زیاد می شنوین چون مهمترین وظیفه اش شست و شوی سلول برای حذف سلول های مرده از محیط سلولیتونه ..

اصلا میدونین بافر PBS چیه؟؟ الان بهتون میگم.. بافر PBS ، بافری است که عموماً با گروه فسفات خود در حفظ PH محیط کمک می کند. اسمولاریته و تراکم یونی آن معمولاً مشابه بدن انسان است. این بافر شامل نمک های سدیم کلراید، پتاسیم کلراید ، سدیم فسفات و پتاسیم فسفات است. این بافر محیط را مشابه حالت in vivo می کند. از این بافر برای ساخت تریپسین ۰٫۲۵% ، شست و شوی سلول های مرده و … استفاده می شود.

خوب محققین محترم محلول بعدی و در حقیقت اخرین محلول مورد نیاز در کارهای روتین کشت سلول ترکیب تریپسین-EDTA ست…که متاسفانه باید درستش کنین..اما نگران نباشین درست کردنش اصلا سخت نیست….ما الان بهتون میگیم…

اصلا تریپسین-EDTA چیکار میکنه؟؟در کار سلولی به چه درد میخوره؟؟؟ الان میگیم… از ترکیب تریپسین و EDTA برای کندن سلول ها از کف فلاسک استفاده می شود. سلول ها پس از رشد به فلاسک می چسبند. میزان چسبندگی سلول ها به کف فلاسک بستگی به نوع سلول دارد. EDTA با خنثی کردن یون Ca و Mg در افزایش دادن به فعالیت تریپسین بسیار تاثیرگذار است. پس هر وقت لازم بود سلول ها رو از کف فلاسک بکنین باید از این محلول استفاده کنین… چه طوری درست میشه؟؟؟ با ما همراه باشین…

روش ساخت
۱- تریپسین ۰٫۲۵g
۲- EDTA 0.01g
۳- PBS(1×) ۱۰۰ml
۴- ظرف درب دار (اتوکلاو شده) یک عدد
۵- ویال استریل به تعداد لازم
۶- پارافیلم به تعداد لازم
ترکیب همه ی مواد فوق باید زیرهود انجام شود. به ۱۰۰ml PBS مقدار۰٫۲۵ gr تریپسین و ۰٫۰۱g EDTA اضافه کرده و خوب هم زنیم تا محلول کاملاً شفاف شود. حال محلول را فیلتر کرده و در ویال های ۲ml ای الیکات کرده دور آن را پارافیلم پیچیده و در فریزر نگهداری می کنیم.

خوب خسته نباشین… محلول ها رو درست کردیم و گذاشتیم داخل یخچال و فریز…حالا میریم سراغ روش های کار با سلول که شامل پاساژ سلول میشه وقتی که سلول ها فلاسک رو پر کردن و باید بین چند تا فلاسک تقسیم بشن…شامل فریز سلول برای پس انداز کردن سلول ها برای روز مبادا و دفریز سلول ها برای استفاده مجدد هستش … نگران نباشین خیلی راحته… پروتکل کامل این تکنیک های کشت سلولی در فایل تکنیک های رایج در کشت سلولی در قسمت پروتکل های سایت موجوده… لطفا مطالعه بفرمایین..

بهتون حق ميدم كه الان يكمي گيج شده باشين…احتياج دارين بصورت تصويري مراحل فوق رو ببينين..ميخواين مجازي برين تو ازمايشگاه كشت سلول؟؟؟؟باشه،ویدیویی از مراحل انجام کار در ازمایشگاه سلولی در کانال نت سای براتون گذاشتیم که شما رو به يك تور چند دقيقه اي براي بازديد از اتاق كشت و اشنايي با تكنيك ها مي بره…اگر مایلید ببینیش برین تو کانال نت سای فقط لطفا براي درك هر چه بهتر ابتدا فايل ها رو مطالعه بفرمايين..

خوب براي حسن ختام مطالب سلولي بهتره كمي هم راجع به تكنيك شمارش سلولي صحبت كنيم
تعيين تعداد سلول ها در كشت،براي استاندارد كردن شرايط كشت و ايجاد دقت در ازمون و تكنيك هاي كمي داراي اهميت مي باشد.

يكي ازروش هاي بسيار متداول در شمارش سلول استفاده از لام هموسيتومتر و شمارش تعداد سلول ها در زير ميكروسكوپ مي باشد.

لام هموسیتومتر یک صفحه ی اسلایدی ضخیم شیشه ای با یک ناحیه ی مرکزی طراحی شده به عنوان چاهک شمارش می باشد. در این قسمت دو شبکه که هرکدام شامل پنج مربع هستند وجود دارد.
 لام نئوبار

خوب حالا چطوري بايد با اين وسيله سلول ها رو بشمريم؟؟؟ اصلا سخت نيست فقط يكم دقت لازم داره…با ما همراه باشين

روش شمارش سلول ها: ابتدا سلول ها را توسط تریپسین از کف فلاسک کنده و با سانژیفوژ محلول رویی را دور ریخته و به رسوبات کف فلاسک ۱ ml محیط کشت با سرم اضافه کرده سپس توسط پیپتاژ کردن یک سوسپانسیون یکنواخت از سلول ها به وجود می آوریم. هنوز تموم نشده…ادامه داره…

حال سطح لام هموسیتومتر را با الکل ۷۰% کاملاً تمیز و خشک می کنیم. حال ۱۰ μL از سوسپانسون سلولی برداشته و با ۱۰ μL از محلول تریپان بلو ۰٫۰۰۴ ترکیب می کنیم. با پیپتاژ کاملاً سلول ها را به رنگ آغشته می کنیم. تریپان بلو نوعی رنگ حیاتی است که قادر می باشد از طریق غشای سلول های مرده وارد شده و سلول ها را رنگ کند. حال یک لامل تمیز روی لام قرار داده و از زیر لامل ۱۰ μL از سوسپانسیون آغشته به رنگ را وارد لام می کنیم. به طوریکه سطح زیر لامل کاملاً پر و یک دست شود. حال لام را زیر میکروسکوپ گذاشته و چهارخانه ی w_1 و w_2 و w_3 و w_4 را شمارش می کنیم.

نمایی از قرار گرفتن سلول ها در زیر لام نئوبار و نحوه ی صحیح شمارش انهانمایی از قرار گرفتن سلول ها در زیر لام نئوبار و نحوه ی صحیح شمارش انها

خوب وقتی سلول ها رو در ۴خانه شمردیم دیگه فقط یک فرمول کوچولو رو باید بلد باشیم وبا کمک جمع سلول ها و اون فرمول تعداد کل سلول های موجود در فلاسک رو بدست بیاریم…
C=n × (فاكتور رقت ×حجم سوسپانسيون)/( V total)
خوب V total هم از طريق ضرب تعداد مربع هايي كه شمردين در ۱۰ به توان ۴- بدست مياد…n هم كه تعداد كل سلول ها در ٤ تا خونه هست…
ديدين چقدر راحت بود..
از اين روش براي بدست اوردن نسبت سلول هاي زنده به مرده هم ميشه استفاده كرد…

خوب حالا اگر احتیاج دارین که کلیپ اموزشی مربوط به شمارش سلول رو ببینین میدونین که باید کجا برین؟؟؟؟ به کال نت سای در تلگرام…

print
Tags: ,


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

8 − 1 =