تست MTT برای بررسی میزان سمی زایی دارو ها بر روی سلول

سلام به محققين و دانشجويان عزيز زيست شناسي…

طبق درخواست خيلي از دوستان نت ساي امروز قصد داره در مورد اندازه گيري ميزان سمي زايي دارو ها بر روي سلول ها  صحبت كنه…
پس با نت ساي همراه باشين

کسانیکه در ازمایشگاه کار سلولی دارند..کسانیکه با دارو ها کار میکنند.. کسانیکه قصد دارند میزان تاثیر و کشندگی دارو و یا دوز موثر ماده ی انتخابیشون رو بر روی سلول ها بررسی کنن حتما حتما باید با روش MTT برای این منظور اشنایی پیدا کنند…
در ازمايشگاه هاي دانشگاه هاي ايران اين تست رايج ترين و پركاربرد ترين تست در بین تكنيك هاي سلوليه و همه ي دانشجو ها اگر كار سلولي و دارويي دارن (بخصوص کسانیکه روی سلول های سرطانی کار میکنن) بايد در انجام اين تكنيك مسلط باشن چون حتما حداقل چند دوره بايد انجامش بدن..
امروز نت ساي مفصل اين تكنيك و روش انجامش رو براتون توضيح ميده…

روش های متعددی جهت سنجش غیر مستقیم میزان تکثیر و زنده ماندن سلول ها وجود دارد. اغلب این روش ها میزان فعالیت یک آنزیم سلولی را درون سلول زنده اندازه گیری می کند. یکی از شناخته شده ترین این روش ها تست رنگ سنجی MTT است.
این تست برای اندازه گیری میزان تکثیر سلول ها در مواجه با عوامل مختلف و تعیین میزان سمیت این عوامل هنگامی که بر روی سلول ها اثر داده می شود کاربرد دارد. درواقع از این تکنیک برای تعیین میزان سمیت یک داروی خاص کمک می گیرند.
تست MTT از روش های کلورومتریک بوده که این روش مرگ سلولی را تخمین می زند و می تواند مرگ سلول را در مراحل خیلی دیر آپاپتوسیس، وقتی متابولیسم سلولی در حال افت است، تشخیص می دهد.

خوب بیاین اول با این شروع کنیم که اصلا MTT چیه؟ چطوری میتونه سلول های زنده رو از مرده در پلیت ما شناسایی کنه؟!!!

 نام این تکنیک برگرفته شده از نام ماده ای با فرمول مولکولی C18 H16 BrN5 S و نام علمی ان:

۳-[۴,۵-Dimethyl thiazol-2-yl]-2,5 phenyltetrazolivm brimide می باشد.

 این ماده به صورت پودری بوده که به شدت به نور حساس می باشد. هنگام استفاده باید با مقدار مناسبی PBS ترکیب شود و به صورت محلول دربیاید. این محلول زرد رنگ بوده و به دلیل داشتن بار مثبت خالص و پتانسیل غشا جذب سلول می شود و از طریق روش اندوسیتوز وارد سلول ها شده و به میتو کندری می رود، سپس در آنجا توسط آنزیم سوکسینات دهیدروژناز میتوکندری که فقط در زنجیره ی تنفسی سلول زنده فعال است به رسوب های بنفش غیر قابل حل در آب تبدیل می شود.

حالا نکته جذاب ماجرا اینجاست که که فقط سلول های زنده می توانند محلولMTT را به یک رسوب فرومازون بنفش غیر محلول در آب تبدیل کنند. کریستال فرومازون قادر به عبور از غشای سلول ها نیستند. این کریستال های بنفش رنگ در حلال های آلی به فرم محلول در می آیند. معمولاً DMSO و SDS در اسید هیدروکلریک رقیق به عنوان حلال مورد استفاده قرار می گیرند. ایزوپروپانول نیز حلال بسیار خوبی برای فرمازان است اما به علت گرانی کمتر مورد استفاده قرار می گیرد.

پس تا اینجای کار فهمیدیم که اگر سلول های موجود در پلیتمون زنده باشن تحت تاثیر ماده MTT به رنگ بنفش در میان.. حالا چطوری تفاوت شدت رنگ را در پلیت ها از هم تشخیص بدیم؟؟؟

تراکم نوری محلول حاصل را می توان با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج ۵۷۹ نانومتر با طول موج مبنای ۶۳۰ نانومتر اندازه گیری کرد.  باتوجه به اینکه واکنش احیای MTT به فرومازون فقط در سلول های زنده رخ می دهد که دارای آنزیم دهیدروژناز فعال هستند پس مقدار عددی به دست آمده توسط این تکنیک به طور مستقیم با تعداد سلول های زنده در ارتباط است.

پس تا اینجا متوجه شدیم که در این سنجش میزان فرومازان تولید شده توسط سلول های تیمار شده با داروی خاص را با میزان فرمازان تولید شده توسط سلول های شاهد که دارویی دریافت نکرده اند مقایسه می کنند و از این مقایسه میزان اثر آن عامل خاص را روی مرگ و مهار رشد سلول ها تعیین می نمایند.
پر واضح است که هرچه میزان جذب خوانده شده نسبت به حالت کنترل کمتر باشد می توان نتیجه گرفت که تعداد سلول های زنده کم شده و مهار رشد بیشتری صورت گرفته است.

پلیت MTT

اینم یک شکل جذاب از یک پلیت ۹۶ خونه بعد از اضافه کردن MTT و حلالش DMSO… هر چه چاهک بنفش تر باشه یعنی تعداد سلول های زنده ی موجود در ان بیشتره..

Eliza Reader

اینم شکل دستگاه Eliza Reader که باهاش طول موج هر چاهک محاسبه میشه.. هر چه چاهک بنفش تر باشه طول موج نشون داده شده توسط دستگاه برای اون چاهک بیشتره…

حالا که به اینجا رسیدیم باید با واژه ی IC50 اشنا بشیم.. وقتی دارین رقت های مختلف داروتون رو روی سلول امتحان میکنین باید به دنبال رقتی باشین که در اون نیمی از سلول هاتون زنده و نیم دیگر مرده باشن..به این دوز ،دوز IC50 میگوییم. که در حقیقت همون درصد توان حیاتی سلول ها در مقابل دوز مشخصی از داروی ماست..
حال بسته به اینکه هدف از ازمایش چیست دوز مورد نظر را انتخاب میکنیم.. در بیشتر پژوهش ها دوز های بالاتر از IC50 انتخاب میشوند، به این معنا که تعداد بیشتری از سلول های موجود در پلیت زنده مانده باشند…

حالا حتما براتون این سوال پیش اومده که توان حیاتی سلول ها چطوری حساب میشن؟؟ جواب فرمول روبروئه.. درصد توان حیاتی= ( جذب نمونه ی تیمار شده)/(جذب نمونه ی کنترل) ×۱۰۰

خوب حالا که اصول این تست رو شناختیم حالا باید بدونیم چطوری باید انجامش بدیم… این تست شاید موقع خوندن پروتکل راحت بنظر بیاد اما چون تجربه و عوامل متعددی در موفقیت اون دخیلند معمولا در دفعات اول خوب جواب نمیده و شما نیاز به تکرار خواهید داشت ( اینو گفتم تا از جواب نگرفتن سریع ناامید نشین..)
حواستون باشه مهمترین عامل در درست انجام دادن این سنجش نحوه ی کاشت سلول ها در پلیت ۹۶ خونه است… بسته به اینکه با چه مدل سلولی کار میکنید و سرعت رشد سلول چگونه است باید در شمارش سلول برای کاشتن در پلیت دقت کنید… میتوانید با مطالعه ی مقاله های مختلف تعداد مناسب سلول ها برای کاشتن رو پیدا کنید…

عامل موفقیت بعدی، پیدا کردن دامنه ی مناسبی از دوز های داروست… اینکه از چه دوز هایی برای سنجش استفاده کنید در موفقیت شما در سنجش تاثیر بسزایی دارد.. برای یافتن دوز ها میتوانید باز هم به مقالات مختلف رجوع کنید و یا با ازمون و خطا دامنه ی مناسب دوز داروی خود را پیدا کنید…

خوب با توجه به اینکه پروتکل طولانیه در اینجا نکات کلیدی گذاشته میشه و بعدش شما میتونین پروتکل کامل انجام تست MTT رو از قسمت پروتکل های ازمایشگاهی پیدا کنین و بخونینش.

پس بريم سراغ نكات كليدي…
١-حواستون به شمارش صحيح سلول ها براي هر چاهك باشه..اگر در شمارش سلول مشكلي دارين ما در نت ساي به طور كامل نحوه ي شمارش رو توضيح داديم پس يكمي بگردين تا پيداش كنين…
٢- حواستون باشه تا محلول سلوليتون همگن باشه تا تراكم سلول ها در هر چاهك يكسان بمونه اينجوري تاثير دارو بر روي جمعيت سلوليتون دقيقتر خواهد بود..
٣-براي بالا بردن دقت كار براي هر دوز انتخابيتون چندين چاهک تكرار بگذاريد(حداقل ٣تا) و جذب خود را از طريق ميانگين سه عدد نزديك به هم انتخاب كنيد..
٤- براي هر رده ي سلولي حداقل سه بار ازمايش رو تكرار كنيد تا احتمال وقوع خطا كاهش پيدا كنه..
٥- دقت كنيد هر دارو مدت زمان اثر متفاوتي داره برخي دارو ها در چند ساعت و برخي ديگر طي چند روز اثر خودش رو ميگذاره..ميتونين اين مدت زمان تقريبي رو از مقالات پيدا كنين وگرنه مجبورين خودتون زمانهاي مختلف رو امتحان كنين…
زياد شد نه؟؟!!اما باور كنين اين نكات خيلي بدردتون ميخورن…

خوب نکات مهم کار تموم شد حالا زود باشین برین پروتکلش رو از قسمت پروتکل ها دانلود کنین. برای دیدن کلیپ انجام کار هم میتونین یکسری به کانال نت سای در تلگرام بزنین من اونجا کلیپ مربوط به انجام تست MTT رو گذاشتم.

خسته نباشین…

print
Tags: ,


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

هجده − 15 =