ترانسفورماسیون

سلام به همراهان عزیز نت سای

علی رغم کارایی بالای الکتروپوریشن در انتقال ژن به داخل باکتری ، بدلیل نیازمندی این روش به ابزار ها ودستگاه های تخصصی و گران قیمت که ممکن است در همه ی ازمایشگاه ها موجود نباشد، امروز قصد داریم پروتکل مولکولی ساده ای را در وبلاگ قرار دهیم تا با کمترین هزینه و ساده ترین وسایل ازمایشگاهی بتوانید یک ترانسفورماسیون موفق داشته باشید… پس با ما همراه باشید…

 

برای انجام یک ترانسفورماسیون عالی اول باید باکتری ها مستعد بسازیم که روش ساختش هم در وبلاگ و هم در قسمت پروتکل های سایت موجوده . وقتی باکتری مستعد رو ساختیم حالا میتونیم ترانسفورماسیون رو شروع کنیم…

خوب حالا که باکتری مستعد با کیفیت بالا ساختیم میریم سراغ اصل ماجرا که انتقال پلاسمید به داخل یاکتری (ترانسفورماسیون) است…ترانسفورماسیون باکتری اشرشیاکلی سویه ی DH5α و یا TOP10
مقدار ۱µg از DNA پلاسمیدی به ۵۰ µL از سلول مستعد اضافه میکنیم، سپس به مدت ۳۰ دقیقه روی یخ قرار داده میشود. پس از آن به مدت ۲ دقیقه روی هات بلاک با دمای ℃۴۲ قرارمیگیرد. هدف از اینکار ایجاد شوک حرارتی در سلولها است. سپس مجددا میکروتیوپ به مدت ۲ دقیقه روی یخ قرار داده شده و بدنبال آن مقدار ۱ml محیط کشت LB مایع به آن اضافه و به مدت ۱ ساعت در انکوباتور شیکردار ℃۳۷ با دور ۱۸۰ rpm انکوبه میشود تا باکتری ها در آن رشد کنند. پس از اتمام این زمان، میکروتیوپ از انکوباتور خارج و به مدت ۱۰ دقیقه با دور ۶۰۰۰rpm سانتریفیوژ شده تا باکتری ها رسوب کنند. بیشتر مایع رویی خارج و رسوب باکتریایی در باقیمانده ی مایع رویی(حدود۱۰۰ µL ) حل شده و مقدار ۵ الی ۱۰ میکرولیتر از آن برداشته و بوسیله ی لوپ استریل روی پلیت حاوی محیط کشت LB جامد شامل آنتی بیوتیکی که باکتری به ان بواسطه ی وجود پلاسمید ترانسفرم شده حساس نیست ، کشت داده شده و به مدت ۱۶ ساعت در انکوباتور ℃۳۷ انکوبه می گردد.

انتخاب سلول های ترانسفورم شده
فقط سلول های ترانسفورم شده توانایی رشد در پلیت حاوی آنتی بیوتیک را دارند. هدف از این کار غربالگری سلول های ترانسفورم شده از ترانسفورم نشده هاست و ژن مقاومت به آنتی بیوتیک مربوطه که در پلاسمید حمل می شود، نوعی مارکر شناساگر به حساب می آید. در واقع مارکر ژنی است که یک خصوصیت متمایز به سلول های ترانسفورم شده می بخشد و آنها را قابل شناسایی از انواع ترانسفورم نشده می کند. ژن شناساگر معمولا ژن مقاومت به یک آنتی بیوتیک یا ژن کدکننده ی یک آنزیم خاص است که فعالیت آن از طریق ایجاد یک رنگ یا یک ماده ی خاص قابل تشخیص باشد.

بررسی سریع پلاسمیدهای ترانسفورم شده با استفاده از بافر کرکینگ
برای اطمینان از حضور پلاسمید مربوطه در باکتری های ترانسفورم شده علاوه بر غربال باکتری ها با استفاده از مارکر ژنی، می توان با استفاده از یک روش سریع باکتری را لیز کرده و از حضور پلاسمید موردنظر در آن اطمینان حاصل کرد. برای اینکار ابتدا به طور تصادفی چندین تک کلونی از پلیت حاوی کلونی های باکتری ترانسفورم شده، برداشته شده و هرکدام جداگانه به ۵ml محیط کشت LB حاوی آنتی بیوتیک مربوطه انتقال داده شده و به مدت ۱۶ ساعت در انکوباتور شیکردار ۳۷ درجه با دور ۱۸۰ rpm قرار داده می شوند. سپس مقدار ۲ml از آن سانتریفیوژ شده و پس از خارج کردن مایع رویی مقدار ۱۰۰µL از بافر کرکینگ به رسوب اضافه شده و شدیدا ورتکس می شود تا رسوب در آن حل شده و سپس به مدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق انکوبه می شود تا بافر مذکور سلول ها را لیز کند. پس از آن به مدت ۱۵ دقیقه با دور ۱۲۰۰۰ rpm سانتریفیوژ می شود تا اجزای سلولی و پروتئین های باکتریایی رسوب کنند. نهایتا مقدار ۱۰ الی ۲۰ میکرولیتر از مایع رویی، که حاوی اسیدهای نوکلئیک است، روی ژل آگاروز۰٫۷ % بارگذاری می شود تا با دیده شدن پلاسمیدهای موردنظر روی ژل صحت انجام ترانسفورماسیون تأیید گردد.

اگر برای ساخت ژل اگاروز مشکل دارین روش ساخت ژل های اگاروز با درصد های مختلف و انجام الکتروفورز در قسمت بررسی کیفی و کمی RNA اورده شده لطفا به اونجا مراجعه کنین…

print
Tags: ,


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

20 − 4 =