استخراج RNA

سلام به همه ی دانشجویان پرتلاش و محققین هدفمند علوم زیستی…
امروز طبق درخواست خیلی از همراهان نت سای قصد داریم در مورد یکی از مهمترین مراحل مولکولی ازمایشگاه صحبت کنیم و اونهم مرحله ی استخراج RNA از سلول و بافت هست…
این مرحله از اون جهت بسیار حائز اهمیته که نقش مهمی در مراحل بعدی ازمایشتون مثل سنتز cDNA و بررسی تغییرات بیان ژن با PCR داره…
خیلی از شما ممکنه برای یک ژن PCR بزارین اما باند خوبی نبینین یکی از دلایل اصلی ایجاد مشکل در PCR بد بودن کیفیت RNA استخراجی شماست…
امروز قصد داریم در نت سای پروتکل تضمینی استخراج RNA از سلول و بافت رو قرار بدیم..مطمئن باشین اگر موارد ذکر شده رو به کار ببرین صد در صد RNA ای با کیفیت بالا استخراج خواهید کرد…پس با نت سای همراه باشین….

اول با استخراج RNA از سلول شروع میکنیم…
متاسفانه در ایران بیشتر دانشگاه ها و اساتید راهنما چون پول و بودجه کافی ندارن تا کیت های مخصوص استخراج RNA رو بگیرن دانشجو ها مجبورن از روش هایی همچون استفاده از RNA XPLUS و یاtrizol برای استخراج RNA های سلولی استفاده کنند بهمین جهت ما هم امروز پروتکل هر دو روش استخراج رو در وبلاگ قرار میدیم…
پس با ما همراه باشین..

خوب بیاین شروع کنیم…
تصور کنین در ازمایشگاه شما در روز های قبل سلول های مورد نظرتون رو در پلیت های ۶ خونه و یا حتی فلاسک T25 کاشتین تا تیمارشون کنین… لازمه بهتون بگم اینکه سلول ها رو در چه پلیتی بکارین کاملا بستگی به میزان نیازتون به RNA داره عموما برای بسیاری از سلول ها از جمله سلول های سرطانی بهتره از پلیت های ۶ خونه و یا فلاسک T25 استفاده کنین تا مقدار بیشتری RNA بتونین استخراج کنین…
بعد از کاشتن سلول ها باید بسته به ازمایشتون سلول ها رو با دارو و یا ماده ای که میخواین اثرش رو در تغییرات بيان ژن هاتون بررسی کنین تیمار کنین…دقت کنین اینکه از چه دوزی ویا چه مدت زمان اثر دارو برای سلول هاتون استفاده کنین رو باید از روش هایی چون MTT بدست بیارین…(روش MTT مفصل در وبلاگ توضیح داده شده)
خوب…حالا ما سلول هایی داریم که با ماده ی مورد نظرمون تیمار شدن و دقیقا شرایطی دارن که ما میخوایم در اون تغییرات بيان ژن هامون رو بسنجیم… از اینجا کار استخراج RNA شروع میشه…

همانطور که گفتیم استفاده از RNA XPLUS و Trizol از روش های مرسوم در اکثر ازمایشگاه های ایران است.. اساس این روش بر مبنای ماده گوانیدین تیوسانات و فنل – کلروفرم می باشد…
طبق تجربه اکثر دانشجوها معتقدند که با استفاده از trizol باعث استخراج RNA با کیفیت تری میشه اما من معتقدم اساس کار استخراج بر مبنای تجربه و دقت در حین ازمایشه پس بین این دو ماده تفاوتي قائل نیستم… اما عموما استفاده از RNA XPLUS رایجتره پس اول با اون شروع میکنم….

قبلش بزارین برای درک بهتر یک نگاه اجمالی به کل مراحل کار بیندازیم تا بفهمیم اصلا ما باید چه مراحلی رو دنبال کنیم و چرا؟؟؟( هرگز و هرگز در کار ازمایشگاهی بدون دونستن دلیل ماده ای اضافه نکنین حتما بدونین هر ماده چکاری انجام میده اینجوری راحت تر میتونین troubleshooting کنین…)..
پس بیاین یک بررسی اجمالی از مراحل کلی کار داشته باشیم بعدش پروتکل ها رو بزاریم…

به طور کلی استخراج RNA با استفاده از روش فنل-کلروفرم از ٦ مرحله ی کلی تشکیل شده:
۱- جداسازی سلول ها از فلاسک یا پلیت که عموما در این مرحله از تریپسین-EDTA استفاده میشه…
۲- جداسازی نوکلئوپروتئين ها از سایر اجزای سلولی و خارج نمودن ان از غشای سلول که برای اینکار باید کل مجموعه ی سلول را تخریب کنیم و یک ترکیب همگن از نوکلئوپروتئين ها ایجاد کنیم.. اینجاست که RNA XPLUS و یا Trizol به کمک میان و با لیز کردن سلول ها نوکلئوپروتئین ها رو از غشا خارج می کنن…
۳- در مرحله ی بعد RNA را از DNA و پروتئین های سلولی جدا می کنیم…این مرحله مهمترین مرحله در کاره..چون به واسطه ی استفاده از کلروفرم در ویال سه فاز تشکیل میشه که فاز زیری مربوط به پروتئین، فاز میانی مربوط به DNA و فاز رویی RNA است… باید دقت کنیم که فقط فاز رویی رو با سمپلر بکشیم و وارد فاز میانی نشیم…

سه فاز ایجاد شد در ویال بعد از اضافه کردن کلروفرم

۴- مرحله ی بعد رسوب سازی RNA است.. که با اضافه کردن ایزوپروپانول سرد به ویال محتوی فاز رویی و سانتوریفوژ ویال صورت میگیره…
۵- مرحله ی شستشوی RNA با اتانول ۷۵% مرحله ی پنجمه…
۶- در نهایت مرحله ی محلول سازی RNA هست که در این مرحله RNA ای رو که در ته ویال رسوب کرده رو با اب DEPC حل میکنیم…
وقتی تمام این مراحل را انجام دادیم حالا باید کیفیت RNA رو بررسی کنیم که بعد از ارائه ی پروتکل اون رو هم توضیح میدم…

پروتکل هر دو روش trizol و RNA XPLUS تقریبا یکیه یعنی میزان و مدت زمان اضافه کردن مواد در هر دو روش عموما یکیه پس اگر ما یکی از این دو را بلد باشیم استفاده از اون یکی هم برامون مقدوره… پس ما فایل pdf روش استخراج با RNA XPLUS رو در قسمت پروتکل های ازمایشگاهی و  ویدیوی اموزشی روش TRIZOL رو در کانال نت سای براتون میزاریم…
پس با ما در سایت و کانال نت سای همگام باشین..

استخراج RNA از بافت نیز با کمک RNAXPLUS و یا trizol طبق پروتکل بالا است اما در کار با بافت مرحله ی هموژنیزه کردن بافت خیلییییی مهم است.. چون بافت نسبت به سلول سفت تر است عموما بعد از وزن کردن و جداکردن مقدار مشخص ابتدا به بافت به ازای ۱۰۰ میلیگرم بافت ۱ml تیازول یا RNA XPLUS اضافه میکنیم و بعدش زیر هود با سرسمپلر در پلیت های پتریدیش کاملا میکوبیم و ورتکس میکنیم تا محلول شفاف بدست بیاد…
هر چقدر این مرحله رو طول بدیم بهتره تا کاملا بافت هموژن بشه ( عموما یک تا یک و نیم ساعت باید طول بکشه) پس صبور باشین.
استرس نداشته باشین با استخراج RNA از سلول تفاوت انچنانی نداره فقط مرحله ی هموژن کردنش کمی سخت تر و زمان بر تره….

اهمیت استخراج RNA به تجربه و دقت کار بر میگرده… چند تا نکته رو اینجا یاداور میشم که نقش مهمی در بالا بردن کیفیت RNA استخراج شده تون داره…

بدلیل حساس بودن RNA به محیط اطراف بهتره که مراحل استخراجRNA زیر هود انجام بشه. از سوی دیگر در تمام مراحل کار حتما یک ظرف یخ در کنارتون داشته باشین و ویال ها و مواد رو روی ان نگه دارین.
سعی کنین حتما از دستکش های لاتکس که فاقد پودر هستن استفاده کنین..
تمام مواد استفاده شده در استخراج باید سرد سرد باشن پس انها رو در فریزر نگه دارین و یا از شب قبل در فریزر بزارین.

در مرحله ی جداسازی فاز ها اصلا فکر نکنین هر چه بیشتر از فاز رویی بردارین بهتره!!!حواستون باشه کیفیت کار از کمیت مهمتره پس نهایتا ۳۰۰ تا ۴۰۰ لاندا از فاز رویی بردارین..
حواستون باشه برای مراحل سانتریفوژ باید از سانتویفوژ یخچال دار استفاده کنین..
در مرحله اخر هم که مرحله ی خشک شدن اتانوله عجول نباشین حتما صبر کنین تا کاملا اتانول از ویال بپره تا احتمال الودگی RNA تون کمتر باشه…
در حل کردن RNA با اب DEPC دقت کنین تا زیاد اب نریزین چون RNA تون خیلی رقیق میشه و در مرحله سنتز cDNA به مشکل بر میخورین… به میزان رسوبتون نگاه کنین و بعد اب DEPC رو اضافه کنین…

اگر تمام این موارد رعایت کنین بهتون قول میدم RNA ای با کیفیت فوق العاده استخراج خواهید کرد فقط یادتون باشه در استخراج دقت و حوصله شرط اوله پس استخراح رو برای روزی بزارین که هم زمان کافی داشته باشین و هم اصلا خسته نباشین….

خوب  دیگه تموم شد. برای اینکه متوجه بشین RNA خوبی استخراج کردین بهتره یکسری به مطلب بررسی کیفی و کمی RNA استخراج شده بزنین.

برای دیدن کلیپ ها هم حتما به کانالمون در تلگرام با نام @netsaai مراجعه کنین.

print
Tags: ,


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

9 − دو =