استخراج پلاسمید از باکتری (Plasmid Preparation)

سلام به همه ی دانشجویان و محققین عزیز همراه با نت سای…
امروز طبق درخواست متمادی بسیاری از شما عزیزان تصمیم داری در مورد استخراج پلاسمید از باکتری های ترانسفرم شده صحبت کنم.
قبل از اینکه مبجث رو شروع کنیم بهتره کسانیکه هنوز پروتکل ترانسفرماسیون رو مطالعه نکردن برن و اون رو بخونن تا متوجه بشن قبل از مرحله ی استخراج و خالص سازی پلاسمید از باکتری ما چه کارهایی انجام دادیم… پروتکل هم در سایت نت سای و هم در کانال موجوده…بگردین پیداش می کنین
خوب پس اماده این شروع کنیم؟؟ با ما همراه باشین….

خوب بیاین اولش یکمی راجه به استخراج پلاسمید از باکتری ها توضیح بدیم بعد پروتکل انجام کار رو با هم مرور کنیم.
روش استخراج پلاسمید با نام Plasmid Preparation یک تکنیک رایج برای جداسازی و خالص سازی پلاسمید از درون باکتری است.

انواع مختلفی از این روش بر اساس اندازه ی محیط کشت باکتری و میزان پلاسمیدی که از استخراج بدست میاریم وجود داره…

۱- روش Minipreparation: این روش بسیار سریع بوده و بیشتر در مراحل کلونینگ برای انالیز کلونی های باکتری استفاده میشه.. مقدار DNA ی پلاسمیدی که با این روش بدست میاد ۵۰ تا ۱۰۰ ug هستش.

۲- روش Midipreparation: مقدار پلاسمیدی که از این روش بدست میاد در حدود ۱۰۰-۳۵۰ µg هستش.

۳- روش Maxipreparation: این روش یکی از روش های رایج می باشد که مقدار ۵۰۰-۸۵۰ µg پلاسمید از ۱۰۰-۲۰۰ ml از محیط کشت باکتری به ما میده.

۴- روش Megapreparation: این روش در حدود ۱٫۵ تا ۲٫۵ mg پلاسمید از محیط کشتی معادل ۵۰۰ml تا ۲٫۵L به ما میده.

۵- روش Gigapreparation: این روش مقدار ۷٫۵–۱۰ mg. پلاسمید از محیط کشتی معادل ۲٫۵-۵ L به ما میده.

خوب همونطور که گفتم رایجترین نوع استخراج پلاسمید در ازمایشگاه ها روش maxiprep هستش و ما هم امروز قصد داریم روش انجام اون رو توضیح بدیم..
اما خبر خوشحال کننده اینکه اساس و مواد در همه ی این روش ها یکسانه و چیزی که متفاوته مقدار اضافه کردن مواد و مدت زمان انجام کاره… پس اگر یکی از روش ها رو بلد باشین بقیه شون هم راحته.

به طور کلی مراحل استخراج و خالص سازی پلاسمید به سه مرحله تقسیم میشه:
۱- رشد باکتری های حاوی پلاسمید در محیط کشت مایع (مرحله ی پیش کشت)
۲- لیز باکتری ها
۳- خالص سازی پلاسمید

خوب بیاین فرض کنیم که شما تصمیم گرفتین پلاسمید خاصی رو از باکتری های ترانسفرم شدتون استخراج کنین.
برای اینکار در روز اول باید پیش کشتتون رو بذارین..چطوری؟؟؟
الان بهتون میگم…هر استادی عموما برای پیش کشت پروتکل خودشو میده.منم انواع پروتکل ها رو استفاده کردم اما بهترین پروتکل برای بدست اوردن میزان مناسب باکتری که همشون سرحال باشن پروتکل زیره…
اول دقت کنین که تمام مراحل انجام پیش کشت باید در کنار شعله و در فضای کاملا استریل باشد.
از پلیت محتوی کلونی های باکتریتون یک تا دو کلونی بردارین( حتما تک کلونی باشن). بعدش این کلونی ها رو در یک ویال ۲ml ای حاوی ۱ml محیط LB مایع همراه با ۱ul انتی بیوتیک اضافه میکنیم ( پلاسمید مورد نظر ما باید دارای قطعه ی مقاومت به انتی بیوتیک مزبور باشد تا فقط باکتری هایی که ما میخواهیم و پلاسمید ما درش هست رشد کنن).
بعدش ویال را به انکوباتور شیکر دار مخصوص باکتری با دمای ۳۷ درجه و دور ۱۸۰rpm منتقل میکنیم.
بعد از گذشت ۲ ساعت ویال را خارج کرده و ان را به فالکون ۱۵ محتوی ۲ml محیط LB مایع همراه با ۲ul انتی بیوتیک منتقل میکنیم و این بار میگذاریم ۵ ساعت در انکوباتور شیکر دار بماند.
در اخر پس از ۵ ساعت محتویات فالکون ۱۵ را به ارلن حاوی ۱۰۰ml محیط LB مایع همراه با ۱۰ul انتی بیوتیک اضافه میکنیم و میگذاریم تا فردا صبح در انکوباتور شیکر دار بچرخه..

مرحله ی پیش کشت باکتری مون تموم شد فردا صبحش که بیایم میبینیم که ارلن مون کاملا کدر شده… کدر شدن به منزله ی رشد باکتری ها در محیط کشتمون هست..
حالا ما ۱۰۰ml باکتری ای داریم که فقط حاوی پلاسمید مورد نظر ما هستن..
البته برای اطمینان ار وجود پلاسمید مورد نظرمون در باکتری باید یک تست تکمیلی هم انجام بدیم… که اون هم اسمش تست Cracking هستش که در قسمت ترانسفورماسیون نحوه ی انجامش رو کامل توضیح دادم..میتونین برین و مطالعه اش کنین.

مرحله ی بعدی مرحله ی لیز باکتری ها است که از مهمترین مراحل استخراج پلاسمید می باشد.برای این مرحله هر کیت بخصوصی بافر های خودش رو داره اما اساس کار همه ی اونها یکسانه…
پس ابتدا نقش بافر ها رو در مرحله ی لیز باکتری توضیح میدم…
در مرحله ی لیز باکتری ما از ۶ مدل بافر استفاده می کنیم.دقت کنین هدف از استفاده از این بافر ها جداسازی پلاسمید از باکتری هاست.

۱- اولین بافر اسمش Suspension buffer هست. نقش این بافر از بین بردن دیواره ی باکتری ها برای دسترسی بهتر به محتویات داخل باکتریه.

۲- دومین بافر Lysis buffer هست که همونطور که از اسمش برمیاد از بین برنده ی اورگانل های داخل باکتریه.

۳- سومین بافرNutralization buffer هست که سبب ممانعت اثر Lysis buffer بر روی DNA داخل باکتری میشه

۴- بافر بعدی اسمش Equilibrium buffer هست که از اون برای شستشوی ستون های مخصوص جداسازی پلاسمید ها استفاده می کنیم. یعنی قبل از وارد کردن مخلوط باکتری به ستون ابتدا این بافر رو به داخل ستون میریزیم تا غشای ستون نرم بشه.

۵- چهارمین بافر Washing buffer هست که سبب شستشوی ستون و خروج محتویات باکتری از داخل ستون میشه در ایم مرحله پلاسمید به ستون متصل شده.

۶- و در نهایت اخرین بافر Elusion buffer هست که کارش اینه که سبب جداسازی راحت تر پلاسمید ها از بقیه قطعات نوکلئوتیدی شده و کمک میکنه پلاسمید های متصل به ستون راحت تر از ستون کنده شده و به داخل فالکون استریل ریخته بشن.

همونطور که گفتم اکثر کیت های استخراج پلاسمید این بافر ها رو دارن اما چنانچه شما در زمره ی دانشجویانی هستین که استادتون پول کیت نمیده و مجبورین خودتون بافر ها رو درست کنین اصلا نگران نباشین ما در اینجا پروتکل ساخت بافر ها رو براتون میذاریم.
ساختنشون یکم زمان بر هست اما تجربه ثابت کرده که اگر با دقت درستشون کنین و PH شون رو دقیق تنظیم کنین خوب جواب میدن ( درست کردم که میگم)

قبلش باید یاداوری کنم که مقادیری که میگم برای ۱L بافر هستش و اگر میخواین کمتر درست کنین با توجه به حجمی که میخواین درست کنین از مقادیر ذکر شده نسبت بگیرین.

Suspension Buffer
Tris-base         ۶٫۰۶g
EDTA-2H2O      ۳٫۷۲g
مقادیر ذکر شده رو در ۸۰۰ml اب dH2O حل کنین. بعدش درون استیرر خوب هم بزنین سپس با HCl به ph =8 برسونین. وقتی به ph=8 رسید به حجم ۱L برسونینش و بعد به ازای هر یک لیتر ۱۰۰mg RNAaseA به ان اضافه کنین.

Lysis Buffer
NaOH (200mM)       ۸٫۰۹g
SDS solution20%      ۵۰ml
مقدار گفته شده از NaOH را در ۹۵۰ml اب dh2o حل کنین و بعد به ان ۵۰ml SDS 20% اضافه کرده و به حجم ۱L برسونین.بعدش حدود ۱۰ دقیقه روی استیرر بذارین تا حسابی حل بشه.

Nutralization buffer
مقدار ۲۹۴٫۵g پتاسیم استات را در ۵۰۰ml اب dH2O حل کنین و بعدش با در حدود ۱۱۰ml از glacial acetic acid اون رو به PH=5.5 برسونین. سپس این مقدار رو با dH2O به حجم ۱L برسونین.

Equilibrium buffer
NaCl (750mM)                ۴۳٫۸۳g
MOPS (free acid 50mM)   ۱۰٫۴۶g
مقادیر ذکر شده رو در ۸۰۰ml آب dH2O حل کنین بعد از اینکه PH ش رو به ۷ رسوندین سپس به ان ۱۵۰ml ایزوپروپانول خالص و ۱۵ml محلول Triton x100 (10%) اضافه کنین وبعدش کل مواد رو با dH2O به حجم ۱L برسونین.

Wash buffer
NaCl(1M)            ۵۸٫۴۴g
MOPS( 50mM)     ۱۰٫۴۶g
مقادیر بالا رو در ۸۰۰ml اب dH2O حل میکنین بعد به PH=7 میرسونین و در نهایت به ان ۱۵۰ml ایزوپروپانول ۱۵% اضافه میکنین. و در نهایت با اب به حجم ۱L می رسونین.

Elusion buffer
NaCl (1.25 M)       ۷۳٫۰۵g
Tris-Cl (50mM)       ۶٫۰۶g
مواد فوق رو با ۸۰۰ml اب dH2O حل میکنین و سپس با HCl به ph=8.5 می رسونین. بعدش ۱۵۰ml ایزوپروپانول ۱۵% بهش اضافه کرده و با اب به حجم ۱L می رسونین.

خوب واقعا خسته نباشین… درسته که درست کردنشون یکم اعصاب خورد کنه اما مطمئن باشین اگر خوب و با دقت درستشون کنین حتما کار میکنن و فرقی با بافر های کیت های گرون قیمت ندارن..
حالا که بافر ها رو درست کردیم و میدونیم هر بافر وظیفه اش چیه دیگه وقتشه که بریم سراغ مرحله لیز کردن باکتری برای جداسازی پلاسمید ها…
پس با ما همراه باشین…

بعد از انجام پیش کشت و درست کردن بافر ها نوبت میرسه به مرحله ی لیز باکتری..
پس تا اینجای کار ما در روز قبل ۲ تا تک کلونی از پلیت باکتری برداشتیم و پیش کشت گذاشتیم و بعد از گذشتن یک overnight حالا یک ارلن محتوی ۱۰۰ml محیط LB مایع همراه با باکتری مورد نظرمون داریم ( قبلا گفتیم که چون به محیط باکتری انتی بیوتیکی اضافه کردیم که فقط پلاسمید مورد نظرمون نسبت بهش مقاومه الان تقریبا مطمئنیم که فقط باکتری هایی که دارای پلاسمید ما هستند تونستند در محیط LB مایع رشد کنن.)
بعدشم برای اطمینان از اینکه باکتری هامون پلاسمید مورد نظرمون رو حمل میکنن تست Cracking گذاشتیم و وقتی نتیجه تست رو روی ژل ۰٫۷% بردیم و پلاسمیدمون رو در جایگاه سایز خودش دیدیم حالا میتونیم مرحله ی لیز کردن باکتری ها رو شروع کنیم.

قبل از شروع کار باید چند تا نکته رو بگم.
۱- فالکون ها و ویال هایی که در طول کار استفاده میکنین باید حتما استریل و اتوکلاو شده باشند.
۲- اگر هم دارین کار سلولی انجام میدین و هم کار باکتری حواستون باشه که فالکون هاش از هم جدا باشه.
۳- بافر هایی که استفاده می کنین رو حتما قبلش خوب بهم بزنین تا اگر رسوباتی دارن خوب حل بشن.
۴- تمام مراحل قبل از بردن روی ستون باید روی یخ اجام بشه.
۵- قبل از شروع کار سانتریفوژ یخچال دار رو به دمای ۴ درجه برسونین تا در کارتون توقف ایجاد نشه.
۶- در بین بافر هایی که استفاده میکنین بافر Elusion باید گرم باشه پس حتما قبل از استفاده اون رو در بن ماری به درجه حرارت ۵۷ درجه برسونین ( این کار خیلیییییی مهمه و همه انجام نمیدن و شاید استباه کارشون در اینجا باشه).
خوب فکر کنم نکات مهم تموم شد حالا کارمون رو شروع می کنیم
ابتدا ارلن حاوی ۱۰۰ML باکتری رو از انکوباتور شیکردار بیرون میاریم. بعد در کنار شعله (دقت کنین حتما در کنار شعله) کل استوک رو به دو تا فالکون ۵۰ استریل منتقل میکنیم.
حالا سریعا فالکون ها رو در سانتریفوژ یخچالدار که قبلش دماش رو به ۴ درجه رسوندیم با دور ۱۲۰۰۰rpm به مدت ۲۰ دقیقه سانتریفوژ میکنیم.
بلافاصله بعد از خارج کردن فالکون ها ار سانتریفوژ اون ها رو روی ظرف یخ میذاریم.
مایع رویی رو دور میریزیم. رسوبات ته فالکون باکتری های ما هستند.
دقت کنین اگر باکتری هاتون خوب در محیط رشد نکرده باشن شما در این مرحله رسوب خیلی کمی دارین..

خوب حالا همونطور که فالکون ها روی یخ هستن به هر کدومشون ۴ml از Suspension buffer که از یخچال درش اوردیم اضافه میکنیم.بعد به شدت ( دقت کنین به شدت هر چه تمام تر) پیپتاژ میکنیم. این مرحله خیلیییییی مهمه پس زیاد براش وقت بذارین، با حوصله و صبر زمان زیادی پیپتاژ کنین. حالا میبینین که محتوی داخل فالکونتون شیری رنگ میشه.

بعدش به هر فالکونتون ۱۲ml از Lysis buffer اضافه کنین. و بعد در حدود ۲ دقیقه top & down کنین و بعد به مدت ۴-۵ دقیقه بذارین تو دمای محیط بمونه.

حالا به هر فالکونتون ۱۲ml از بافر Nutralization اضافه کنین و در حدود ۱ دقیقه top & down کنین و بعدش ۱۵ دقیقه بزارینش توی فریزر (دمای -۲۰ درجه).
بعد از گذشتن ۱۵ دقیقه باید محتویات ویالتون رو به فالکون های مخصوص سانتریفوژ سیگما ( که از روز قبل اتوکلاوشون کردین ) منتقل کنین. حالا برای متعادل سازی دو فالکون رو با ترازو هم وزن کنین و بذارینشون توی سانتریفوژ سیگما با دمای ۴ درجه و دور ۱۴۰۰۰rpm به مدت یک ساعت.
دلیل استقاده از سانتریفوژ سیگما اینه که دور بالایی داره و برای کار ما که دوری معادل ۱۴۰۰۰rpm لازم داره مناسبه.

خوب زمانی که سانتریفوژ کارش رو انجام میده فرصت مناسبیه تا ما ستون هامون رو اماده کنیم.
حواستون باشه که هر ستون مخصوص یک نوع پلاسمید باشه. برای اینکه قاطی نکنین اسم پلاسمید رو روی ستون بنویسین تا همیشه اون پلاسمید خاص رو از همون ستون رد کنین.
خوب حالا ستون رو با holder روش روی یک فالکون۵۰ قرار میدیم.و به ستون بافر Equilibrium اضافه میکنیم.
دقت کنین که اگر ستونتون قبلا استفاده شده حتما یکبار با اب ولرم ان رو بشوریم و بعدش بافر رو به ستون اضافه کنیم.

بعد از گذشت یک ساعت فالکون ها رو از سانتریفوژ در میاریم اگر دیدین که هنوز رسوب ایجاد نشده بذارین باز هم در حدود نیم ساعت سانتریفوژ بشه.
اما اگر فقط یکمی مایع روییتون کدر بود باید روی ستونتون رو با کاغذ فیلتر بپوشونین و بعد ابی که نیمه ولرم هست رو از فیلتر رد میکنیم و بعدش مایع رویی فالکون رو به ستون اضافه کنین.
چرا از فیلتر استفاده کردیم؟؟؟ چون دانه های پروتئینی شناور در محلول رویی سوراخ های ستون رو میگیرن و کیفیت ستون رو کاهش میدن.

بعد از اینکه محلول رویی فالکون رو از ستون عبور دادیم حالا ۱۲ml بافر Washing buffer رو به ستون اضافه می کنیم تا از ستون رد بشه. اینکار رو دو بار تکرار کنین.
حالا فالکون زیر ستون رو بردارین و مایع درونش رو دور بریزین.
بعدش زیر ستونتون یک فالکون استریل بذارین و۷ml بافر Elusion buffer( که حتما قبلا گرمش کردین ) رو از ستون رد کنین. این کار را دوبار تکرار کنین.
خوب خسته نباشن محلولی که از ستونتون خارج میشه محتوی پلاسمید مورد نظر شماست.

خوب حالا نوبت میرسه به اخرین مرحله که خالص سازی پلاسمید تون هست.
برای اینکار باید ۱۰ml ایزوپروپانول سرد (دقت کنین حتما سرد باشه) به فالکونتون اضافه کنین و بذارین ۱۵ دقیقه در فریزر -۲۰ بمونه.
بعدش فالکون رو به سانتریفوژ یخچالدار با دمای ۴ درجه و دور ۸۰۰۰rpm به مدت یک ساعت منتقل کنین.
این مرحله خیلی استرس داره چون ممکنه بعد از دراوردن از سانتریفوژ رسوب نبینین پس دوباره به مدت نیم ساعت سانتریفوژ رو تکرار کنین.
بعدش مایع رویی رو دور بریزین و به رسوبتون ۱۰ml اتانول ۷۰% سرد اضافه کنین و دوباره در دمای ۴ درجه و دور ۸۰۰۰rpm به مدت ۲۰ دقیقه سانتریفوژ کنین.
اگر بعد از این مدت رسوب ندیدین این مرحله رو دوباره تکرار کنین.
خوب حالا میرسیم به مرحله ی ابگیری DNA از اتانول :
در این مرحله مایه رویی فالکون رو دور بریزین و فالکون رو زیر هود با در باز بذارین تا اتانول اضافی اون کاملا بپره.
وقتی فالکونتون کامل خشک شد در حدود ۱۰۰ul اب تزریقی بهش اضافه کنین
دقت کنین که مقدار اب تزریقی بستگی به میزان رسوبتون داره اگر اب زیاد بریزین غلظت DNA تون کم میشه. اما اگر درست و طبق پروتکل کار کنین این مقدار اب مناسبه.
یک دقت دیگه هم که باید داشته باشین نحوه ی اضافه کردن اب به فالکونه. سعی کنین اب رو کاملا به دیواره های فالکون بریزین و جند بار دیواره های رو با اب بشورین تا اگر DNA به دیواره چسبیده کاملا شسته بشه.
خوب حالا ۱۰۰ul اب محتوی DNA رو به ویال استریل منتقل می کنیم و در فریزر -۲۰ نگهداری میکنیم.

خوب خسته نباشین. کارتون تموم شد. حالا یه سوال از کجا بفهمیم که کیفیت کارمون خوب بوده؟؟؟
درسته باید از دو روش بررسی کیفی و کمی DNA استفاده کنیم (درست شبیه به بررسی کیفیت RNA)
پس ابتدا بررسی کیفی روی ژل اگاروز رو شروع میکنیم.
اول یک ژل ۰٫۷% درست میکنیم. ( چرا؟؟؟ چون پلاسمید قطعه ی بزرگیه و باید درصد ژلتون پایین باشه تا قطعات بزرگ راحت ازش رد بشه)
مارکر (DNA Ladder) در چاهک دوم یادتون نره…ح.استون باشه که Ladder در اینجا با Ladder در روی ژل بردن RNA فرق میکنه و قطعات اون بزرگتره. پس اشتباها از همون Ladder ای که برای RNA استفاده میکنین استفاده نکنین.
در حدود ۱ul از DNA تون رو با ۰٫۵ul از Loading dye مخلوط کنین و به چاهک سوم ژل اضافه کنین.
حالا دستگاه رو روشن کنین و بذارین نمونه ها حرکت کنن بعد از حدود نیم ساعت ژلتون رو با اتیدیوم بروماید بشورین و بعد کمی شست و شو در اب ان را با دستگاه ببینین.
اگر در مرحله کار با الکتروفورز مشکلی دارین برین به قسمتی که بررسی کیفی RNA رو توضیح دادم اونجا جواب همه ی سوالاتون رو پیدا میکنین.
DNA پلاسمیدی روی ژل اگارزاینم یه عکس خوشگل از ژل الکتروفورز برای دو مدل پلاسمید. در چاهک دوم DNA Ladder ، در چاهک سوم و چهارم یک مدل پلاسمید و در چاهک پنجم هم یک مدل پلاسمید دیگه run شده .

به اندازه ی پلاسمید ها دقت کنین. باید سایز پلاسمید مورد نظرتون رو بدونین تا در این جور مواقع بر اسا اندازه ی ladder تون بتونین پلاسمید مورد نظرتون رو پیدا کنین.
در اینجا هم مثل حالت RNA نباید روی ژل اسمیر ببینیم چون اسمیر به معنای دگرده شدن DNA تونه.خوب برای بررسی کمی هم باید از نانودراپ استفاده کنین.
دیگه الان حتما میدونین که این دستگاه غلظت DNA تون رو همراه با احتمال الودگی به پروتئین یا اتانول رو بهتون میده.
اگر نمیدونین این دستگاه چطوری کار میکنه بهتره برین به قسمت بررسی کمی کیفیت RNA در سایت و یا کانال اونجا کاملا در این مورد توضیح دادم…

دیگه واقعا خسته نباشین…
دقت کنین که اگر کار Cloning و یا Transfection و Transduction میخواین انجام بدین مرحله ی استخراج پلاسمید خیلی مهمه. کیفیت پلاسمید در جواب گرفتن خوب تکنیک های بالا خیلی کارسازه…
پروتکلی که بهتون دادم نتیجه ی ماه ها troubleshooting هستش و کاملا امتحانشو پس داده پس اگر با دقت انجام بدین صد در صد پلاسمید با کیفیت عالی استخراج می کنین.
دقت یعنی حواستون به مقادیر، کیفیت بافر ها ، مدت زمان ها باشه.

امیدوارم با این پروتکل بتونین پلاسمید های عالی با غلظت و کیفیت بالا استخراج کنین. اگر باز هم سوالی داشتین حتما ازم بپرسین…

موفق باشین

ویدیوی زیر کلیپی کوتاه از روش استخراج پلاسمید در مقادیر کمه که بهش میگن miniprep. ببینین و لذت ببرین.

print
Tags:


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

8 − دو =