Transfection

سلام میکنم به همه ی شما محققین و دانشجویان عزیز همراه با نت سای….
امروز برای بسیاری از شما روز موعوده…چرا؟؟؟ چون میخوایم با هم راجع به یکی از پر بحث ترین تکنیک های ازمایشگاهی مولکولی یعنی Transfection صحبت کنیم… پیام های بسیاری از شما عزیزان دریافت کردم که ازم خواسته بودین تا کامل راجع به این تکنیک صحبت کنم…
پس با نت سای همراه باشین تا با هم تمام مراحل Transfection به طور کامل بررسی کنیم.

اول با یک سوال شروع میکنم…اصلا transfection چیه؟؟؟ به چه دردی میخوره؟؟؟ چرا انقدر اسمش همه جا هست؟؟؟
ببینین به طور کلی به روش انتقال اسید های نوکلئیک به داخل سلول های یوکاریوتی Transfection میگن…یعنی اینکه اگر شما بخواین یک قطعه ی ژنی خاص رو به داخل سلول یوکاریوتی هدفتون وارد کنین تا بیان داشته باشه باید از تکنیک Transfection استفاده کنین..

سوال دوم: فرق Transfection با Transformation در چیه؟؟؟
میدونم که الان همگی تون با واژه ی ترانسفورماسیون و نحوه ی عملکرد ان کاملاااا اشنا هستین اما بازم برای کسانیکه تازه به جمع ما پیوستن باید بگم ترانفورماسیون به تکنیک انتقال DNA به داخل باکتری گفته میشه.. یادتون میاد که پلاسمید مون رو بعد از استخراج و یا Cloning وارد باکتری میکردیم تا بیانش رو ببنیم؟؟؟!!!
البته لازمه بگم بعضی وقتا فقط به انتقال DNA به سلول یوکاریوتی جانوری Transfection میگن و برای انتقال DNA به سلول های گیاهی هم از اسم Transformation استفاده میکنن..

trans

حالا یه سوال دیگه ازتون دارم بنظرتون اگر ما DNA یا قطعه ی ژنی مون رو وارد سلول یوکاریوتی کنیم بیانش چطوریه؟؟؟ طولانی مدته یا کوتاه مدت؟؟
جوابش اینه : بیان طولانی مدت و به اصطلاح پایدار یک ژن خارجی درسلول مستلزم ورود ان ژن به داخل توالی ژنومی سلول میزبانه بعنی باید به روشی DNA رو وارد سلول هدف بکنیم که از طرق مختلف مثل Homologous Recombination وارد ژنوم سلول هدف بشه در این صورت DNA ما همراه با ژنوم سلول هدف بیان پایدار خواهد داشت.
البته مسئله ای خیلی ها بهش دقت نمیکنن اینه که بعضی وقتا حتی اگر DNA ما وارد ژنوم هدف هم بشه اما محصول پروتئینی ان برای سلول هدف کنده باشه یا هموستازی سلول رو بهم بزنه سلول هدف ما از بین خواهد رفت… اینجاست که انتخاب نوع سلول هدف برای ما حائز اهمیت میشه…
اما بیان کوتاه مدت یا اصلاحا ناپایدار به این معناست که قطعه ی DNA ی خارجی ما داخل ژنوم نمیشه و خودش به تنهایی با ساختاری که داره در هسته ی سلول رونویسی شده و یا اگر بصورت RNA باشه در سیتوزول ترجمه میشه این بیان پایدار نیست چون در پی میوز های متعدد سلول هدف رقیق شده و یا محصول دگرده میشه.

خوب حالا میخوایم بصورت کلی انواع روش های Transfection رو با هم نام ببریم و بعد یکیشون رو به طور کامل توضیح بدیم..
روش های Transfection به دو دسته ی غیر ویروسی (non viral based) و ویروسی (Viral based) تقسیم میشن.
به روش های transfection بر پایه ی استفاده از ویروس ها روش Transductionمیگن که در اینده به طور کامل در کانال براتون توضیحش خواهم داد.
اما روش های غیر ویروسی خودشون به دو دسته روش های شیمیایی و غیر شیمیایی تقسیم میشن…

از رایج ترین روش های شیمیایی میتوان به روش Lipofection یعنی انتقال DNA به کمک لیپوزوم ، روش کلاسیک کلسیم فسفات ، روش استفاده از پلیمر های کاتیونی اشاره کرد.
از روش های غیر شیمیایی میتوان به Electroporation ، Sonoporation و یا Cell squeezing اشاره کرد.
یادتون باشه اگر به دنبال بیان پایدار هستین اصلا از روش های شیمیایی استفاده نکنین بهترین روش ها برای بیان پایدار داشتن روش های بر پایه ی ویروس و یا micro injection هست.

مقایسه transfection های پایدار و ناپایدار

مقایسه transfection های پایدار و ناپایدار

ما در این مبحث سعی داریم در مورد روش های شیمیایی رایج در ازمایشگاه ها برای Transfection صحبت کنیم…
یکی از را های بسیار کارامد در Transfection، روش Lipfection هست. در این روش شما فقط احتیاج به Lipofectamine دارین حالا اگر در یک مدت زمان مشخص DNA تون رو با Lipofectamine مخلوط کنین DNA شما در یک ساختار وزیکولی لیپوزومی قرار میگیره که بدلیل تشابه غشای لیپوزوم با غشای سلول DNA شما به راحتی وارد سلول هدف میشه…
کارایی این روش خیلی بالاست و اصلا دنگ و فنگ ساخت بافر و مانند اینها رو نداره اما خوب روش پرهزینه ایه و به همین دلیل بسیاری از اساتید در ازمایشگاه هاشون از این روش استفاده نمیکنن پس ما خیلی وارد جزئیات این روش نمیشیم چون همیشه طرف دانشجویانی هستيم که باید با حداقل هزینه کارشون رو جلو ببرن..
اما بهتون قول میدم در اخر مبحث امروز یک کلیپ قشنگ از روش Lipofection برای دانشجوهاي خوش شانس و پولدار بذارم!!!!

خوب حالا میخوایم راجع به روش کلاسیک Transfection که چون هزینه زیادی نداره در اکثر ازمایشگاه های ایران انجام میشه صحبت کنیم…
این روش ، روش کلاسیک کلسیم فسفات هست. این روش روشی ارزونیه و تمام موادش به راحتی در ازمایشگاه ها در دسترسه اما به جاش چند تا بدی هم داره اونم اینه که رسوب کلسیم فسفات یک رسوب سمیه و ممکنه بسیاری از سلول ها رو بکشه ، از سوی دیگه روی تمام انواع سلول ها جواب نمیده و در نهایت set up کردنش کمی زمانبره چون میزان PH بافر ها ، دما و غلظت مواد در جوابدهی ان خیلی موثره…

با وجود تمام این محدودیت ها اما این روش باز هم از روش های رایج ازمایشگاه هاست. من سعی میکنم تا اونجا ممکنه تمام امکان ایجاد خطاها رو بهتون بگم تا زود تر بتونین با این روش جواب بگیرین.

خوب اول میخوام مبنای عملکرد این روش در انتقال DNA به داخل سلول رو براتون بگم…
ببینین در این روش شما از Cacl2 به همراه بافر HEPES-buffered saline solution با نام اختصاری HBS برای انتقال DNA به داخل سلول استفاده میکنین…
بنظرتون اینا چیکار میکنن؟؟مکانیسم عملشون چیه؟؟؟
ببینین ترکیب این دو ماده با هم سبب ایجاد رسوب کلسیم فسفات میشه یعنی فسفات موجود در بافر HBS با کلسیم این رسوب رو ایجاد میکنه ( چرا؟؟؟ چون فسفات با بار منفی جذب کلسیم با بار مثبت میشه درست مثل اتصال DNA به کلسیم) . حالا این کمپلس سبب انتقال راحت DNA به سطح سلول هدف و وارد شدنش به واسطه ی اندوسیتوز میشه… بافر HBS در شکل گیری بهتر کمپلس رسوب و در نتیجه وارد شدن هر چه بهتره DNA و همچنین متعادل سازی PH محیط واکنش نقش موثری داره پس در ساختنش خیلی باید دقت کنیم.

روش کلسیم فسفات

خوب با توجه به اهمیت بافر HBS در بالا رفتن کارایی Transfection به روش کلسیم فسفات باید در ساخت ان بسیار بسیار دقت کنین. PH این بافر از موارد بسیار مهمیه که در کیفیت کارتون خیلیییی تاثیر میذاره…
میتونین برای سهولت در کارتون اون رو خریداری کنین اما اگر توان خریدش رو ندارین خودتون به روش زیر درستش کنین:
۱- Glucose (without water) (11mM) 100mg
۲- Nacl (280mM) 800mh
۳- Kcl (10mM) 36mg
۳- Na3Hpo4(+H2O) (1.5mM) 9.3mg
۴-HEPES (50mM) 500mg
۵-H20 50ml
مواد بالا رو با هم ترکیب کنین بعدش به PH=7.05 برسونین بعدش زیر هود فیلتر کنین و توی ویال های ۲ml ای الیکات کنین. دورش فویل بپیچین و توی فریزر نگهداری کنین.
به PH خیلییییییی همیت بدین چون مهمترین عامل در بالا بردن کیفیت HBS تون هست.

خوب حالا میخوام قبل از شروع کار یک مسئله ی بسیار مهم رو بهتون بگم… ببینین ما برای Transfection ابتدا قطعه ی DNA مون رو عموما از پلاسمید استخراج میکنیم( با روش maxi Prep که قبلا در سایت و کانال مفصل گفتم) و بعدش باید با کمک Cacl2 و hbs اون رو به داخل سلول هدفمون وارد کنیم…

حالا ازتون یک سوالی دارم اگر ما تمام این کارها رو کردیم و نتونستیم در سلول هدفمون قطعه ی ژنيمون رو پیدا کنیم از کجا بفهمیم ایراد کار در کجاست؟؟؟ ایا DNA مون رو خوب استخراج کردیم؟؟؟ ایا HBS خوبی درست کردیم؟؟؟ و یا همه ی مراحل رو درست رفتیم و ایراد از سلول هدف ماست؟؟؟ چطوری میتونیم روشمون رو درست set up کنیم؟؟؟
برای حل این مشکل ما احتیاج داریم که قبل از ورود DNA مون به سلول هدف ابتدا اون رو به صورت ازمایشی وارد سلولی بکنیم که اطمینان داریم کارایی بالایی در جذب DNA خارجی داره و اگر ما همه ی مراحل رو درست انجام داده باشيم صد در صدد باید بیان قطعه مون رو در اون سلول ببینیم.
قانع شدین؟؟؟ حالا بنظرتون اون سلولی که این قابلیت رو داره اسمش چیه؟؟؟
اسم این سلول HEK293T هستش.
هر کسی که کار Transfectionو یا Transduction انجام میده حتما اسم این سلول شنیده.
این سلول ها سلول های جنینی کلیه انسان (Human Embryonic kidney cells) هستند که در سال ۱۹۷۳ با adenovirus ترانسفرم شدند. از جمله مهمترین واریانت های HEK293 در انجام Transformation واریانت HEK293T هستش. چرا؟؟ چون این واریانت دارای SV40 Large T-antigen هستش که باعث میشه پلاسمید هایی که دارای ناحیه ی شروع همانندسازی SV40 هستند به راحتی به صورت اپی زومال در درون سلول هدف همانند سازی کنند. اینجوری کارایی همانندسازی و بیان ژن در درونشون بسیار بالا میره. از سوی دیگه این سلول ها نسبت به سایر سلول ها راحت تر قطعه ی DNA خارجی رو به درون خودشون وارد میکنن.

بدلیل کارایی بالا ی این سلول ها در Transfection همیشه برای بررسی مراحل کار و set up کردن تکنیک ابتدا قطعه ی ژنی رو وارد HEK293T میکنن و و وقتی راه تمام خطاها را گرفتند بعدش DNA رو با همین روش وارد سلول هدف اصلی میکنند.

البته باید بگم از دیگر موارد استفاده از HEK در ساختن ویروس هاییست که میخواهیم به درون سلول هدف وارد کنیم و وقتی که میخواهیم سلول اصلی رو در محیط شرطی حاوی یک پروتئین خاص کشت بدیم.
در این حالت ابتدا با روش کلسیم فسفات قطعه ی ژن پروتئین ترشحیتون رو وارد HEK293T می کنین. بعدش که ژن در HEK بیان شد پروتئین ها به فضای محیط کشت HEK ریخته میشن و حالا با جمع اوری محیط میتونین سلول های اصلیتون رو در اون محیط حاوی پروتئین کشت بدین…
Immunofluorescent HEK 293 cells

Immunofluorescent HEK 293 cells

ببینین سلول HEK293T چون یک سلول دستکاری شده است یکمی لوسه یعنی کار با اون کمی نسبت به سلول های دیگه سخت تره…
چند تا نکته هست که باید بهتون در مورد کار با HEK بگم:
۱- اصلا سعی نکنین از سلول های HEK پیر استفاده کنین.. یعنی چی ؟؟؟ یعنی حتما شماره ی هر پاساژ رو روی پلیتتون بنویسین و سعی کنین برای Transfection از پاساژ های زیر ۴ استفاده کنین.
۲- سلول HEK در اثر پاساژ های مداوم مرفولوژیش رو خیلی زود از دست میده .حتی پاساژ بالا در بالا امدن سلول در مرحله ی دفریز هم خیلی موثره…
۳- اگرسلول HEK تازه و خوبی پیدا کردین سریعا چندین فریز ازش بگیرین و اصلا سعی نکنین HEK تازه تون رو زیاد پاساژ بدین ( بازم میگم هرگز کیفیت رو فدای کمیت نکنین).
۴- سلول HEK کمی سخت به فلاسک میچسبه پس سعی کنین در مرحله ی تریپسین زدن زیاد اون رو نگه ندارین چون ممکنه بعد از پاساژ به فلاسک جدید نچسبه

۵- سعی کنین ابتدا HEK رو در فلاسک T25 کشت بدین و بعدش به فلاسک T75 منتقل کنین چون تجربه ثابت کرده در صورت انتقال مستقیم به T75 ممکنه از میزان چسبندگی سلول کم بشه..
۶- سعی کنین بعد از ریختن سلول به فلاسک حتما کمی فلاسک رو به صورت هشتی تکون بدین تا سلول خوب در فلاسک پراکنده بشه چون اگر فواصل بین سلول ها در فلاسکتون زیاد بشه امکان اینکه خوب رشد کنه خیلی کم میشه…
۷- حواستون به شکل سلول باشه چون ممکنه سلول شکل خودش رو از دست بده مثلا خیلی گرد با خیلی کشیده بشه که در اینصورت اصلا نباید برای Transfection ازش استفاده کنین.
۸- اصلا سعی نکنین سلول هاتون در فلاسک از یه حدی بیشتر بشن همون confluency 70% کافیه چون اگر زیاد تو فلاسک بمونه کنده میشه.
۹- محیط فلاسک رو حتما فردای روز دفریز عوض کنین چون ممکنه DMSO خای باقیمونده در محیط سلول رو از بین ببره.
خیلی از این نکات که گفتم برای کار با دیگر سلول ها هم صدق میکنه..
چقدر نکات زیاد شد اما همشون خیلی واجب بودن باید بهتون میگفتم. پس شما هم سعی کنین این نکات رو رعایت کنین تا HEK هاتون برای Transfection سالم و سرحال باشه.

HEK293Tشکل بالا سمت راست بخوبی نشون میده وقتی سلول ها بدرستی در فلاسک پراکنده باشن شما زیر میکروسکوپ چی باید ببینین…
سلول های شکل سمت راست کاملا سالم و سرحالن و اماده هستند تا شما Transfection رو انجام بدین…

بررسی انواع conflueny در کار با HEK

بررسی انواع conflueny در کار با HEK

پس یک جمع بندی کلی از HEK بکنیم:
سعی کنین حتما HEK هاتون سالم ، سرحال و مرفولوژی درست باشن.
مقدار سلول در فلاسک نه خیلی زیاد و نه خیلی کم باشه. تجربه به من ثابت کرده confleuncy 60-70 بر ای کار مناسبه. شاید یکمی کمتر از عکس وسطی بالا…

چرا میگم confluency خیلی زیاد نباشه؟؟؟ چون شما چند روز با این سلول ها کار دارین و اگر خیلی زیاد باشن ممکنه در حین کار بمیرن و کنده بشن و کیفیت کارتون پایین بیاد.
اصلا اصلا اصلا از پلیتی که سلول هاش به صورت جزیره ای رشد کرده برای Transfection استفاده نکنین.
خوب فکر کنم دیگه تمام موارد مربوط به کار با سلول HEK293T رو گفتم. حالا در پایان بحث امروز یک ویدئو از نحوه صحیح پاساژ سلول های HEK براتون میذارم..

خوب حالا که بخوبی با سلول هايHEK رفیق شدیم بیاین یکمی هم درباره ی ویژگی های قطعه ی DNA ای که باید به HEK و یا سلول هدفمون منتقل کنیم صحبت کنیم…
ببینین یکی از مهمترین موارد در انتقال صحیح قطعه ی ژنیمون اندازه ی قطعه است. هر چه قطعه بزرگتر باشه انتقالش سختره. پس سعی کنین قطعه ای که میخواین منتقل کنین فقط قسمت های ضروری رو داشته باشه که سایزش نرمال بشه..
یادتونه در کار با باکتری وقتی پلاسمید ها رو در باکتری Transform میکردیم از یک Selection marker انتی بیوتیکی استفاده میکردیم تا به کمک اون بفهمیم در کدوم باکتری قطعه مون بیان داره؟؟؟ خوب Transfection هم مثل ترانسفورمیشنه و شما باید یک مارکری همراه با ژنتون داشته باشین تا مطمئن بشین ژنتون درست وارد شده…

 چون در Transfection شما با سلول های یوکاریوتی سرو کار دارین پس زیاد رایج نیست تا از مارکر های انتی بیوتیک استفاده کنین در اینجا همراه با قطعه معمولا ِک ژنی وارد میکنند که پس از بیان زیر میکروسکوپ فلورسانس از خودش رنگ ساطع میکنه و این باعث میشه شما مطمئن بشین که قطعه تون وارد سلول شده…
از رایج ترین نوع این مارکر ها GFP یا همون Green Fluorescent protein و یا Jred هستش که GFP بعد از بیان از خودش نور سبز و Jred از خودش نور قرمز ساطع میکنه.

نمایی از سلول های HEK که با GFP ترانسفکت شدن

نمایی از سلول های HEK که با GFP ترانسفکت شدن

نمایی از سلول های HEK که با Jred ترانسفکت شدن

در ترانسفکشن شما عموما از قطعه ی ژنی ای که فقط مارکر GFP و یا هر Selection marker انتخابیتون رو حمل میکنه به عنوان یک کنترل استفاده میکنین.
فقط یادتون باشه قطعه ی Selection marker ای که به تنهایی به درون سلول به عنوان کنترل میفرستین حتما باید همونی باشه که روی قطعه ی اصلیتون وجود داره…
چرا؟ چون طول این قطعات مارکری وکیفیت هاشون ممکنه با هم فرق کنه و اگر شما از یک مارکر دیگه به عنوان کنترل استفاده کنین نمیتونین کیفیت کارتون رو با هم مقایسه کنین چون ممکنه یک ماکربی بخاطر اندازه ی کوچکتر و یا کیفیت بهتر راحت تر وارد سلولتون بشه پس در نتیجه معیار خوبی برای بررسی کیفیت کارتون نیست.

یک نکته ای که متاسفانه خیلی از دانشجوها بهش دقت نمیکنن و بخاطرش استرس میگیرن اینه که فکر میکنن بعد ار ترانسفکشن سلولی که قطعه ی ژنی موردنظرشون رو همراه با مارکر داره باید همزمان با سلولی که فقط مارکر واردش کنه بیان داشته باشه و چون بیان مارکر رو در پلیت سلولی ای که قطعه ی اصلیشون هم وارد شده نسبت به بیان مارکر در پلیتی که فقط مارکر واردش شده کمتر میبینن فکر میکنن کارشون غلط بوده…
اما دوستان اینطوری نیست چرا چونکه قطعه ی ژنی اصلیتون همراه با مارکرش طول بلندتری نسبت به مارکر به تنهایی داره برای همین زمان بیشتری طول میکشه تا بیانش تکمیل بشه پس اگر همزمان بیان دو تا پلیتتون رو یکسان ندیدین استرس نگیرین باید به پلیت حاوی قطعه ی اصلیتون بیشتر زمان بدین.

از طرفی چون معمولا مارکرتون قبل از ژن اصلیتون در قطعه قرار داره زود تر از قطعه ی اصلی بیان نیشه پس شما باید زمان بیشتری بدین تا سلول فرصت کنه و ژن اصلی شما هم بیان بشه..
یک مطلب مهم دیگه در طراحی قطعتون انتخاب پروموتر درسته….این مسئله کمک بزرگی به بیان کوتاه مدت یا طولانی مدت داره.
براساس انتخاب پروموتر خاص شما میتونین بیان رو از یک ماه تا چندین ماه افزایش بدین.
مثلا پروموتور CMV که یک پروموتر ویروسیه سبب بیان قطعه تون تا حدود یکماه میشه اما چنانچه پروموتری مثل Initiation Factor1 رو قبل از ژن اصلی قرار گرفته باشه بیان میتونه تا مدت طولانی حداکثر ۹ ماه ادامه داشته باشه…

 خوب تا اینجای کار خسته نباشین ما تا الان کامل کار با سلول HEK رو یاد گرفتیم و از طرفی میدونیم که قطعه ی ژنی ای که میخوایم وارد سلول کنیم باید چه ویژگی هایی داشته باشه ، مارکر ها رو هم شناخیتیم.
امروز پروتکل Transfection رو شروع نمیکنم چون خیلی طولانی میشه اما میخوایم یه مرحله ی خیلییییییییی مهم قبل از شروع Transfection بهتون بگم که باعث میشه کیفیت کارتون خیلییییییییی بالا بره.
حواستون باشه که خیلی از اساتید این مرحله رو انجام نمیدن و اصلا ازش خبر ندارن پس شما میتونین پایه گذار این step از ترانسفکشن در ازمایشگاهتون باشین
اون مرحله چیه؟؟؟؟

قبل از اینکه اون مرحله ی مهم رو بهتون بگم برای درک بیشتر باید یک توضیح کلی از مراحل کار بگم در جلسات بعد هر مرحله رو با جزییات با هم بررسی میکنیم.
ببینین ترانسفکشن عموما به دو بخش سلولی و مولکولی تقسیم میشه.
بخش سلولی بخش کشت سلول HEK و یا سلول هدفتون در پلیت های ۱۰ سانت و اماده سازی سلول ها برای ترانسفکشنه.
بخش مولکولی بخش اماده سازی محلول ترانسفکشن و مخلوط کردن Cacl2 و HBS و قطعه ی ژنیتونه.
به طور کلی ترانسفکشن در حالت عالی ۳ روز کاری پشت سر هم نیاز داره. البته ما میگیم سه روز چرا؟؟؟ چون یک روز به روزهامون اضافه کردیم . اون هم روز اوله.

این مرحله ای که الان دارم میگم مرحله ی اول کارمونه که معمولا کسی انجام نمیده و حسابی ضرر میکنه..
حالا بیاین با هم شروع کنیم.
شما باید یک روز قبل از seed سلول های HEK در پلیت های ۱۰ سانت ، پلیتتون رو با Poly L Lysin hydrobromide که نام اختصاریش PDL هست بشورین.
حالا بگین چرا؟؟؟ چون PDL سبب افزایش چسبندگی سلول های HEK به پلیت ۱۰ سانتتون میشه… یادتونه گفتم HEK یکمی لوسه و معمولا همه ی سلول هایی که seed میکنین به پلیتتون نمیچسبن؟؟؟ خوب با اینکار چسبندگی پلیتتون رو زیاد میکنین و این باعث میشه فردا که میخوایم سلول در پلیت بکارین efficiency کارتون بالا بره.

یک دلیل مهم دیگه برای اینکار اینه که شما در ترانسفکشن بهتره از محیط کشت بدون FBS استفاده کنین چرا؟؟؟ چون FBS پروتئین هایی داخل خودش داره که ممکنه در کار شما تداخل ایجاد کنه… پس چون میخواین از محیط کشت بدون FBS استفاده کنین چسبندگی سلول هاتون به پلیت کم میشه و با شستن پلیت در روز قبل با PDL شما این مسءله رو جبران میکنین…
خوب قانع شدین که چرا ما این مرحله رو اضافه کردیم؟؟؟ پس با ما همراه باشین تا پروتکبل این مرحله رو بهتون بگم..

شما در این روز یعنی روز اول در زیر هود پلیت های ۱۰cm ای که میخواین فردا سلول های HEK رو در اون بکارین با ۸ml PDL پر میکنین.به طوری که کامل تمام سطح پلیت با PDL پوشونده بشه. بعدش ۲۰ دقیقه صبر میکنین و سپس با حرکات هشتی کاملا PDL رو در پلیت میگردونین.
حالا PDL ها رو از پلیت جمع میکنین و در یک فالکون تمیز میریزین تا بار بعد هم بتونین ازش استفاده کنین.

حالا زیر هود پلیت ها رو دوبار با PBS میشورن و میزارین ۲۰ دقیقه PBS در پلیت بمونه بعدش PBS رو جمع میکنین ( میریزین دور) و نیم ساعت زیر هود به پلیت فرصت میدین تا خشک بشه.
حواستون باشه که پلیت کاملا خشک بشه و گرنه اگر لکه ای PBS در پلیتتون بمونه فردا که میخواین سلول رو یکارین الودگی قارچی خواهید داشت.
بعد از خشک شدن کامل پلیت ها درشون رو ببندین دورشون رو پارافیلم بپیچین و بذارینشون تویخچال تا برای فردا اماده باشن.

قبل از اینکه ادامه ی مطلب رو بگم به چند تا سوالات شما عزیزان در مورد ترانسفکشن جواب مبدم…

چند نفر از شما عزیزان پیام دادین و گفتین که قطعه ی ژنی مورد نظرتون selection marker نداره و ایا شما میتونین بدون قطعه ی مارکر عمل Transfection رو انجام بدین یا نه؟؟؟
ببینین دوستان اگر هدف شما از Transfection الزاما بررسی بیان ژنتون هست میتونین روی قطعه ی اصلیتون مارکر نداشته باشین و بعد از ترانسفکشن و گذشت حداقل ۲۴ساعت ( بسته به سایز قطعه تون) برای ژن مورد نظرتون PCR بذارین و یا اگر پروتئینی تولید کرده باشه با وسترن بلات پروتئین رو پیدا کنین.
اما اگر هدفتون ار ترانسفکشن ایجاد یک جمعیت سلولی خالص هست که تقریبا همشون ژن مورد نظر شما رو داشته باشن حالا باید صد در صد قطعه ی ژنی اصلیتون با مارکر همراه باشه تا شما مطمئن بشین که همه ی سلول هاتون تقریبا ژنتون رو داخل کردند.

سوال دیگری که بعضی ار دوستان پرسیده بودن این بود که چطوری ژن مارکر رو به قطعه ی ژنی اصلیشون اضافه کنین؟!!
جواب این سوال کلونینگ هست. حالا سوال اینجاست که کدامیک از ژن اصلی و یا مارکر شما insert و کدامیک vector هستند. ببینین دوستان جواب این سوال بستگی به نقشه ی ژنیتون داره. شما باید نقشه ی ژنی هر دو تا قطعه رو یعنی هم قطعه ی مارکر و هم قطعه ی ژن اصلیتون رو بدونین و بر اساس جایگاه انزیم های محدود کننده ی روی قطعات با توجه به اینکه کدام انزیم ها را دارین و انتخاب کدام جایگاه های برش به ژن اصلی شما اسیب نمیرساند و از طرفی قطعه ی کوچکتری به شما میدهد وکتور و insert تون رو انتخاب کنین.

خوب حالا که سوالات دوستان رو پاسخ دادم میریم سراغ بقیه ی مراحل کار:
ما دیروز اومدیم چسبندگی سطح پلیت هایی رو که میخواهیم سلول های HEK رو درش بکاریم با PDL بالا بردیم و حالا در روز دوم Transfection میخوایم سلول هامون رو seed کنیم.
ببینین مهمترین اصل در این مرحله انتخاب به اندازه ی تعداد سلول برای کاشتن در پلیت ۱۰ سانته ..چرا؟؟؟ چون همونطور که گفتم confluency سلول ها در روز ترانسفکشن در کیفیت کار خیلی تاثیر کذاره.
شما میتونین با دفعات انجام دادن این مرحله تعداد مناسب سلول HEK که باید seed کنین تا فرداش به confluency تقریبا ۷۰ برسین رو بدست بیارین.
اما تجربه ثابت کرده که اگر سلول های HEK تون صحیح و سالم باشن مقدار ۴ ملیون سلول HEK برای کاشتن در پلیت مناسبه.
ما بازم حواستون باشه که مقدار HEK ای که باید در پلیت بکارین بستگی به کیفیت سلولتون و سرعت رشد اون داره.
دقت کنین بازم میگم به هیچ عنوان از HEK پیر و یا با کیفیت بد استفاده نکنین چون در روز ترانسفکشن خیلی هاشون کنده میشن و میمیرن و کیفیت کارتون پایین میاد.
پس شما در روز دوم باید مقدار تقریبا ۴ ملیون از سلول های HEK تون رو از فلاسک به پلیت ۱۰ سانتی که توش محیط کشت همراه با ۵%FBS ریختین منتقل کنین.
اگر نحوه ی شمارش سلول رو بلد نیستین در کانال و یا سایت قسمت پروتکل های سلولی میتونین پیداش کنین
حالا باید ۲۴ ساعت به سلول ها مهلت بدین تا در پلیتتون رشد کنن و به confluency تقریبا ۷۰درصد برسن.

حالا میرسیم به روز سوم ترانسفکشن یعنی فردای روزی که سلول ها رو seed کردین. صبح اول وقت میاین و سلول ها رو میبینین اگر حالشون خوب بود، خوب چسبیده بودن ، مرفولوژی درستی گرفته بودن ، قشنگ در پلیتتون پخش بودن( جزیره ای نبودن) و confluency شون تقریبا ۷۰ درصد بود میتونین برین مرحله ی بعد در غیر این صورت باید به سلول بیشتر زمان بدین تا رشدش کامل بشه.

HEK293Tدر شکل بالا Confluency سلول ها در حدود ۷۰ تا ۸۰ درصده..

خوب اگر صبح زود اومدین و حال سلول هاتون خوب بود حالا باید خیلی خیلی اروم بطوریکه سلول ها از کف پلیت کنده نشن ۲ بار سلول ها رو با PBS بشورین ( بازم میگم حواستون باشه سلول ها کنده نشن).
بعدش که خوب سلول ها با PBS شسته شدن حالا پلیت رو با محیط کشت بدون FBS پرکنین و اجازه بدین دو ساعت سلول ها در محیط کشت بدون FBS بمونن.
چرا محیط کشت باید بدون FBS باشه؟؟؟
اگر مبحث رو تا الان خوب خونده باشین الان جواب این سوال رو میدونین… درون FBS پروتئین ها و کمپلمان هایی وجود داره که در کار ترانسفکشن ما تداخل ایجاد میکنه و ممکنه ار کیفیت و کارایی کارمون کم کنه.
برای همینه که میگم سلول هاتون باید سالم و سرحال باشن چون از اینجا به بعدمحیط کشتی که به سلول اضافه میکنین فاقد FBSهست.
خوب تا اینجای کار خسته نباشین الان میرسیم به اصلی ترین مرحله ی Transfection و اونهم وارد کردن قطعه ی ژنیمون به داخل سلوله.
خوب اول مرحله ی مولکولیش رو توضیح میدم:
در مرحله ی مولکولی شما باید محلولی که میخواین به سلول اضافه کنین رو درست کنین.
مواد لازم برای انجام این مرحله:
۱- قطعه ی ژنی مورد نظر ( اگر قطعتون داخل پلاسمیده قبلش از طریق maxi prep پلاسمید رو از باکتری تخلیص میکنین و مقدارش رو با نانودراپ میسنجین چون مقداری که باید ازش بردارین بستگی به غلظتی داره که دستگاه نانودراپ بهتون میده اگر هم از طریق کلونینگ درستش کردین باز هم با نانودراپ غلظتش رو اندازه بگیرین)

۲- محلول CaCl2 2.5M ( برای بدست اوردن این مقدار مولاریته از کلسیم کلراید باید بر اساس وزن مولكولي کلسیم کلراید مقدار مشخصی از ان رو با اب مقطر ترکیب کنین تا به این مولاریته برسین).
۳- اب تزریقی
۴- بافر HBS( که طرز تهیه ش رو قبلا بهتون گفتم فقط بازم تاکید میکنم حواستون به PH ش باشه چون خیلییییییی مهمه pH اون باید حدود ۷٫۰۵ باشه.

خوب همه ی این مواد رو میبریم زیر هود. ما برای انجام کار به ورتکس احتیاج داریم پس قبل از شروع کار به دستگاه ورتکس تون الکل بزنین و ببرینش زیر هود.
حالا میخوایم کارمون رو شروع کنیم پس با دقت بخونینش:
شما ابتدا ۵۰۰ul از بافر HBS تون رو بریزین در ویال ۲ml و بذارینش کنار ( اصلا میتونین از ابتدا HBS تون رو در این مقدار الیکات کنین اما اگر هم نکردین در شرایط کاملا استریل زیر هود ۵۰۰ul از HBS تون رو داخل ویال ۲ml ای بریزین و کنار بذارین.
حالا باید در یک ویال ۲ml ای دیگه مقدار مناسبی از DNA تون ( مقدارش بر اساس غلظت DNA تون، کیفیتش ، سایزش و… متفاوته و با troubleshootinh های متعدد به دست میاد) را با ۵۰ul کلسیم کلراید مخلوط کنین و با اب استریل به حجم ۵۰۰ul برسونین.
( قبل از استفاده از DNA حتما اون رو کمی اسپین کنین).حالا کمی ویال رو اسپین کنین و به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق زیر هود قرارش بدین.
بعد از گذشت ۵ دقیقه ویال حاوي HBS رو در مرکز ورتکس بذارین و ورتکس رو روشن کنین حالا در حین اینکه ویال داره روی ورتکش حرکت میکنه و میچرخه شما قطره قطره و به ارامی از ویال مخلوط DNA و CaCl2 تون به HBS اضافه کنین.
این مرحله خیلییییی مهمه و دقت و تجربه ی بالایی میخواد. حتما باید ویال حاوی HBS روی دستگاه ورتکس باشه . دقت کنین حتما مخلوط DNA تون رو قطره قطره به ویال HBS اضافه کنین.

بعد از اضافه کردن قطره ی قطره ی مخلوط DNA و کلسیم کلراید با سر سمپلر ابی حالا کمی باز هم دو مخلوط اضافه شده رو ورتکس کنین و بعد بذارین ۲۰ دقیقه در دمای محیط زیر هود بمونه.
در این مدت پلیت حاوی سلول هاتون رو زیر میکروسکوپ ببینین. الان باید حالشون برای ترانسفکشن خوب باشه و confluency تقریبا ۷۰ داشته باشن. سلول های کنده شده هم خیلی کم داشته باشن.
وقتی ۲۰ دقیقه تموم شد یکمی مخلوط رو پیپتاژ کنین و قطره قطره به همه جای پلیتتون بریزین. دقت کنین همه ی ویال رو در یک نقطه ی پلیت نریزین بلکه سعی کنین در تمام پلیت پراکنده بریزین.
حالا پلیت را به ارامی به صورت X و بینهایت انگلیسی بچرخونین تا مخلوط در همه جای پلیت پخش بشه. دوباره سلول ها رو زیر میکروسکوپ ببینین تا کنده نشده باشن و بعد الکل بزنین و بذارینش توی انکوباتور.
حواستون باشه که انتقال مخلوط به پلیتتون ۲ ساعت بعد از شستن پلیتتون با PBS و اضافه کردن محیط بدون FBS باشه.
۶ ساعت بعد از انجام ترانسفکشن محیط داخل پليت رو خالي كنين و بعد با ۸ml محیط کشت بدون FBS پرکنین.
در این مرحله به ازای ۸ml محیط ، ۵۵ul بوتیریک اسید به محیط اضافه کنین. چرا؟؟؟ چون بوتیریک اسید نقش بافر رو داره و باعث میشه تا PH محیط تغییر نکنه.از طرفی نقش enhancer رو بازی میکنه و سبب میشه ژن سریع تر بیان بشه.
دقت کنین خیلی ها این مرحله رو انجام نمیدن اما اینکار باعث میشه کیفیت کارتون بالا بره.
حالا دوباره سلول هاتون رو زیر میکروسکوپ ببینین و بذارین توی انکوباتور به مدت ۲۴ ساعت. ۲۴ ساعت بعد بیاین و سلول هاتون رو با میکروسکوپ فلورسانت ببینین…
خوب مسلما شما در پلیتی که فقط قطعه ی مارکرتون رو دارین چون قطعه کوچکتره زود تر بیان میبینین پس تا ۲۴ ساعت بعد باید در پلیت کنترلتون بیان رو ببینین اما برای پلیت حاوی قطعه ی ژنیتون بیان ممکنه کمی بیشتر طول بکشه.
در این مرحله ممکنه رسوباب کلسیم فسفات کمی از سلول های شما رو از بین ببرن که از کیفیت کارتون کم میکنه پس به مرحله ی تعویض محیط سلول هاتون بعد ار ترانسفکشن دقت کنین…
شمایی از مراحل کلی ترانسفکشنتوی عکس پایین رسوبات کلسیم فسفات کاملا مشخصه.. ببینین چقدر حال سلول رو بد کرده!!!

توی این عکس رسوبات کلسیم فسفات کاملا مشخصه.. ببینین چقدر حال سلول رو بد کرده!!!

نمایی از سلول های HEK که با GFP ترانسفکت شدن.( اگر کارتون رو درست انجام بدین تمام سلول هاتون GFP رو بیان میکنن)

نمایی از سلول های HEK که با GFP ترانسفکت شدن.( اگر کارتون رو درست انجام بدین تمام سلول هاتون GFP رو بیان میکنن)

نمایی از سلول های HEK که با پروتئین GDNF همراه با مارکر Jred ترانسفکت شدن:

چگونگی استفاده از محیط کشت سلول های ترانسفکت شده ، تخلیص پروتئین و استفاده از سلول های ترانسفکت

ببینین دوستان مطمئنا شما قبل از انجام ترانسفکشن به خوبی از هدف کارتون اگاهین و باید بر اساس هدفتون از محصول ترانسفت شدتون استفاده کنین.
من امروز بر اساس تجربه ی خودم و اکثر دانشجوها چند هدف رو با شما بررسی میکنم. اگر هدف شما اینها نبود میتونین بهم بگین تا راجع بهش صحبت کنیم…
یکی از رایج ترین اهداف در انجام ترانسفکشن استفاده از محیط کشت سلول ها بعد از Transfection ست که به اون Conditional Medium میگن.
تصور کنین که شما دارین با یک سلول خاص سرطانی و یا عصبی کار میکنین. حالا هدفتون اینه که ببینین این سلول عصبی و یا سرطانی شما در شرایط محیطی خاص ( مثلا وجود یک پروتئین خاص در یک غلظت مشخص که میتونه نقش انتی اکسیدانتی داشته باشه و یا پروتئین مهار کننده باشه و یا هر چی بسته به نوع ازمایشتون ) چطوری عمل میکنه و یا اون پروتئین مشخص چه تاثیری در رشد ، مرگ ، تمایز و دیگر سرنوشتهای سلولیتون داره…
اگر جواب این سوال براتون جالبه امروز ما رو همراهی کنین…

به منظور جواب دادن به پرسش بالا شما باید ابتدا قطعه ی ژنی مربوط به اون پروتئین مشخص رو با پروتکلی که گفتم وارد سلول های HEK کنین. بعد از تقریبا ۲۴ تا ۴۸ ساعت ( تمام این مدت سلول ها رو زیر میکروسکوپ ببینین تا متوجه بشین کی سلول ها تقریبا همگی پروتئین شما رو بیان کردند) باید محیط کشت سلول هاتون رو جمع اوری کنین.
البته توجه کنین که برای اینکار باید پروتئینتون ترشحی باشه تا حتما بعد از بیان شدن در سلول HEK به محیط کشت ترشح بشه.
خوب این محیطی که جمع اوری کردین حاوی پروتئین های ترشحی مورد نظرتونه…
حالا باید چیکار کرد ایا میشه مسقیم سلول هدف رو در اون کشت داد یا باید تغلیضش کرد؟؟؟

ببینین پس هدف ما الان رشد دادن سلول های اصلیمون در محیط کشتی هست که حاوی پروتئین ترشح شده از سلول های ترانسفکتمونه…
برای جواب دادن به این سوال که چه غلظتی از پروتئین در محیط کشت میتونه ما رو به هدفمون یعنی تاثیر گذاری بر روی سلول اصلیمون هست برسونه باید مقالات متعددی که در این زمینه نوشته شده رو بخونیم. با خوندن مقالاتی که مسیر کاریشون و هدفشون شبیه کار ماست متوجه میشیم که چه مقدار غلظتی از پروتئین برای کار ما مناسبه….
اگر شما به غلظت پایینی از پروتئین برای تاثیر گذاری روس سلول هدفتون نیاز دارین پس میتونین همون محیط کشتی که سلول های HEK ترانسفکت شده داخلش قرار دارن رو بعد از ۲۴ تا ۴۸ ساعت جمع اوری کنین و سلول اصلیتون رو در اون کشت بدین…

اما در بیشتر حالات ما نیاز به غلظت بالای پروتئین برای تاثیر گذاری روی سلول اصلیمون داریم اگر محیط کشت سلول های HEK ترانسفکت شدمون رو به سلول اضافه کنین تاثیر خاصی رو مشاهده نمیکنیم…
حالا باید چیکار کرد؟؟؟؟
اینجاست که باید محیط کشتتون رو تغلیض کنین.. چطوری؟؟؟ رایج ترین راه برای تغلیض پروتئین های محیط کشت سلول های ترانسفکت شده استفاده ار تون های امیکونه…
این ستون ها دارای غشاهایی با منافذ مختلف هستند که پروتئین ها رو بر اساس سایز و اندازه شون جدا میکنن. پس اگر شما سایز پروتئین ترشحیتون رو بدونین به راحتی میتونین اون رو از محیط کشتتون جدا و تغلیض کنین.

انواع ستون های امیکون

انواع ستون های امیکونستون های امیکون کارایی خیلی بالایی داره و پروتئین های مختف با سایز های مختاف رو بخوبی از محیط جدا میکنن.
این ستون ها دارای انواع مختلفی بر اساس منافذ غشا شون دارند که با کاتاف نامیده میشه…
۵ نوع مختلف از این ستون ها با کاتاف های ۳ ، ۱۰ ، ۳۰ ، ۵۰ و ۱۰۰ وجود داره که شما باید بر اساس سایز پروتئینتون یکیش رو انتخاب کنین.
انواع ستون ها با اندازه های مختلف میتوانند پروتئین ها در سایز های گوناگون رو از هم جدا کنند.انواع ستون ها با اندازه های مختلف میتوانند پروتئین ها در سایز های گوناگون رو از هم جدا کنند.

مراحل جداسازی پروتئین عموما به صورت زیره…
شما ابتدا با یک ستون بزرگتر از سایز پروتئیینتون محیط کشت رو فیلتر میکنین. چون پروتئین شما کوچکتر از کاتاف ستون هست پس از ستون خارج میشه….
حالا در مرحله ی بعد محلول زیری ستون رو با ستونی که کاتاف ان کوچکتر از سایز پروتئینتونه فیلتر میکنین حالا محلولی که در بالا ی ستون جمع شده پروتئین تخلیص و تغلیض شده ی شماست.
فقط حواستون باشه وقتی که میگم فیلتر میکنین یعنی اینکه محیط کشتتون رو به داخل ستون میریزین و بعدش ستون رو به سانتریفیوژ منتقل میکنین. میزارین با دور مشخصی ( عموما ۴۰۰۰rpm مناسبه) به مدت مشخص ( بستگی به سایز پروتئینتئن و انتخاب کاتاف خاصی داره ) سانتریفوژ بشه.

در شکل زیر میبینین که سایز پروتئین همیشه با مدت زمان سانتریفوژ ارتباط مستقیم نداره…

در این شکل میبینین که سایز پروتئین همیشه با مدت زمان سانتریفوژ ارتباط مستقیم نداره...

حالا چند تا نکته هست که باید بهتون بگم:
۱- حتما حتما حتما قبل از اینکه محیط کشتتون رو به داخل ستون بریزین یکبار اون رو با دور حداقل ۲۵۰۰rpm سانتریفوژ کنین تا رسوبات و سلول های مرده درون محیط کشت رسوب کنند و مایع روییتون شفاف بشه… اگر این کار رو نکنین منافذ ستونتون رو میبنده و دیگه نمیتونین ازش استفاده کنین.
۲- برای بالا بردن کارایی ستون بهتره ستونتون قبل از ریختن محیط مرطوب باشه. برای اینکار باید ستونتون رو یکبار با اب دو بار تقطیر و یا PBS بشورین و سانتریفوژ کنین و بعدش محیطتتون رو وارد ستون کنین.
۳- اگر شما استاد خسیسی دارین که مجبورتون میکنه از یک ستون برای چند تا پروتئین استفاده کنین یادتون نره که حتما حتما روز قبل از استفاده از ستون اون رو با الکل ۷۰ % پر کنین و بذارین با دور ۲۰۰۰ سانتریفوژ بشه و بعدش بذارینش زور هود و نور UV رو روشن کنین تا کاملا استریل بشه بعدشم زیر هود یک onernight نگهش دارین تا خشک بشه و بذارینش توی کیسه فریزر و درش رو ببندین تا فردا از ش استفاده میکنین استریل باشه.
۴- حواستون باشه که موقع خارج کردن محلول روییتون از ستون با سر سمپلر زرد کار کنین و به هیچ عنوان نذارین سر سر سمپلر به غشا بخوره چون ممکنه اون رو پاره کنه.
۵- دقت کنین که زیاد ستون رو در سانتیریفوژ نذارین چون سانتریفوژ بالا باعث میشه رنگ محیط خیلی تیره بشه و ویسکوزیته بره بالا که این امر باعث خراب شدن کارتون میشه.

خوب حالا که پروتئینمون رو تخلیص کردیم چطوری غلظتش رو تعیین کنیم؟؟؟
برای تعیین غلظت پروتئینتون میتونین از تکنیک هایی مثل hplc و تست برادفورد استفاده کنین ( در اینده این مفصل راجع به این تکنیک ها با هم صحبت میکنیم)
خوب حالا که غلظت پروتئینتون رو تعیین کردین باید به مقالات رجوع کنین و ببینین غلظت بهینه ی پروتئینتون برای تاثیر گذاری روی سلول چنده… حالا اگر پروتئین شما میتونه توی محیط کشت حل بشه با کمک محیط کشت اون رو حل کنین و یا اگر برای حل شدن به حلال خاصی نیاز داره اون رو در حلال خودش حل کنین و یک استوک اصلی داشته باشین.
حالا با توجه به غلظت بهینه از استوک اصلیتون بردارین و با مقدار مشخصی محیط کشت رقیق کنین و سلول های هدفتون رو در اون محیط کشت بدین.

شکل زیر مقایسه ی سایر ستون ها با ستون امیکونه… قشنگ در شکل مشخصه که فیلتراسیون درست چه محصولی رو به ما میده… به رنگ محیط در بالای فیلتر دقت کنین!!! و به رنگ محلول در پایین فیلتر….

ما تا الان یاد گرفتیم که اگر بخواهیم از پروتئین های ترشحی سلول های transfect شدمون و یا conditional medium استقاده کنیم باید چیکار کنیم.
حالا تصور کنین که کار ما بررسی نقش یک پروتئین در داخل سلول ترانسفکت شدمونه…یهنی میخوایم بدونین وارد شدن فطعه ی ژنی خاص به داخل سلول و بیان اون چه تاثیری در داخل سلول و یا مسیر های مولکولی داخل اون داره…
برای اینکار شما باید بعد از اینکه با ترانسفکشن قطعه تون به داخل HEK کاملا به مراحل کار و کیفیت موادتون مطمئن شدین ترانسفکشن رو با سلول های اصلیتون انجام بدین…
بعد از گذشتن ۲۴ تا ۴۸ ساعت شما باید سلول هاتون رو از کف پلیت بکنین وتست های مورد نظرتون رو روش انجام بدین…
مثلا برای بررسی شدت بیان قطعه میتونین PCR بذارین. برای بررسی پروتئین های داخل سلول میتونین از تکنیک وسترن بلات استفاده کنین.

کار با سلول ترانسفکت شده مشابه سلول عادیه اما نکته ی مهم اینه که چون شما ترانسفکشن انجام دادین و قطعه ی ژنی مورد نظرتون داخل ژنوم سلول نشده بیان ناپایداره پس برای استفاده از سلول و کارهای مولکولی بهترین همون یکی دو روز اول هستش و بعد از اون بیان ژن شما در سلول کم میشه.
به همین دلیلی که گفتم به هیچ عنوان سلول های ترانسفکت شدتون رو فریز نکنین چون کار بیهوده ایه ..( دیدم که میگم)

خوب خسته نباشین. فکر کنم تمام کارهای رایج با محصول ترانسفکت در ازمایشگاه های ایران رو گفتم اما باز هم اگر کارهای دیگری به ذهنتون رسید بهم بگین تا راجع بهش بحث کنیم..
یادتون باشه که میشه با ترانسفکشن بیان پایدار هم داشت اما اینکار مستلزم ورود ژن به داخل ژنوم سلوله که برای اینکار باید سلول هدفتون دستکاری شده باشه تا انزیم های لازم برای ورود قطعه ی ژنیتون به داخل ژنوم رو داشته باشه.

امیدوارم حسابی به مطلب مسلط شده باشین.. اگر سوالی داشتین حتما ازم بپرسین…

موفق باشین….

print
Tags:


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

8 − 2 =