روش استخراج RNA از بافت

روش تثبیت و پایدارسازی RNA در نمونه بافتی جمع آوری شده
۱٫ بلافاصله پس از خارج کردن نمونه از بافت آن را وزن می کنیم.
۲٫ پس از تعیین وزن ، میزان حجم مناسب RNXTM(PLUS) را با نسبت ۱۰ حجم ( تقریبا ۱۰ ماکرولیتر به ازای ۱میلیگرم ) با یک پیپت مناسب به داخل میکروتیوب متناسب ریخته می‌شود.
۳٫ نمونه بافتی را خارج کرده ودر مواردی که ضخامت آن بیشتر از نیم سانتی‌متر بود و بلافاصله به قطعات کوچکتر تقسیم می گردد.
۴٫ دقت شود که نمونه‌ها کاملا در محلول RNXTM(PLUS) غوطه ور باشد.
۵٫ ذخیره سازی: برای یک روز دمای ۳۷،برای ۷روز دمای ۲۵-۱۵ ، برای بیشتر از ۴هفته دمای ۸-۲ و برای مدت زمآن‌های طولانی تر دمای ۲۰- و۸۰- توصیه شده بود که برای اینکارابتدا باید نمونه در داخل محلول به مدت یک شب در دمای۸ -۲ انکوبه شود.
۶٫ برای شروع مراحل lyses و homogenyse بافت کاملا از RNA-Xعاری گردد.
در تمامی مراحل بایستی از ظروف، ميکروتيوب ها، لوله ها و سرسمپلرهاي RNase free که اختصاصاً براي کار با RNA تهيه شده‏اند استفاده شود.از دستکش هاي يکبار مصرف و بدون پودر لاتکس استفاده شود و از تماس با دست خودداري شود زيرا پوست دست حاوي آنزيم RNase است.

مرحله تخلیص RNA
الف: مرحله هموژناسیون
۱- بافت را وزن کرده و به یک میکروتیوب استریل منتقل میکنیم، به ازای ۱۰۰میلیگرم بافت ۱میلی‌لیتر محلول RNXTM(PLUS) به آن اضافه میکنیم، یک ظرف یخ زیر میکروتیوب حاوی بافت قرار داده و با هموژنایزر بافت را هموزنایز میکنیم.(برای حدود ۱۵ثانیه)
نکته عملی: نصف حجم RNA یعنی نیم میلی‌لیتر آن را به بافت اضافه میکنیم و بعد از هموژنایز کردن نصف دیگر را اضافه کرده و به شدت تکان میدهیم.
۲- محلول به‌دست آمده را به مدت ۵دقیقه در دمای اتاق قرار میدهیم
ب: مرحله تجزیه
۱- ۲۰۰ماکرولیتر کلروفرم را به محلول مرحله ۲ اضافه کرده و به مدت۱۵ ثانیه به شدت تکان داده و در دمای اتاق برای ۲- ۳دقیقه انکوبه مینمائیم.
۲- نمونه را با سرعت g 12000برای ۱۵دقیقه در دمای۸- ۲ سانتریفوژ مینمائیم.
ج: مرحله رسوب RNA
۱- پس از سانتریفوژ کردن در مرحله ۴، سه فاز مختلف از مایع تشکیل می‌شود که شامل فاز روئی شفاف محتوی RNA، فاز میانی محتوی DNA، فاز ته نشین شده شامل دبریدها وناخالصی‌های بافتی میباشد که ما فاز روئی را با احتیاط با یک سمپلر مناسب به یک تیوب جدید منتقل میکنیم.
۲- میزان ۵۰۰ ماکرولیتر ایزوپروپانول (به ازای ۱میلی‌لیتر ترایزول اولیه) به نمونه آماده شده اضافه کرده و برای ۱۰ثانیه در دمای اتاق انکوبه مینمائیم.
۳- نمونه را در g 12000برای ۱۰ دقیقه در دمای ۸ -۲سانتریفوژ میکنیم.

مرحله شستشوی RNA
۱- پس از سانتریفوژ کردن در مرحله ۷محلول سطحی دور ریخته می‌شود.
۲- رسوب RNA را با ااتانول ۸۰ درصد (به ازای ۱میلی‌لیتر ترایزول اولیه ۱میلی‌لیتر اتانول ) مخلوط کرده وبه شدت تکان میدهیم.
۳- نمونه را درg 750برای ۵ دقیقه در دمای۸ -۲سانتریفوژ میکنیم.
۴- مایع سطحی را دور ریخته و اجازه میدهیم تا رسوب باقیمانده به مدت ۲-۳دقیقه در هوای خشک قرار بگیرد تا باقیمانده اتانول آن خشک شود.
۵- حدود۵۰ -۲۰ ماکرولیتر آب DEPC را به RNA خشک شده اضافه کرده و چند بار پیپتاژ مینمائیم.
۶- نمونه را به مدت ۱۰دقیقه در ۵۵ درجه سیلیسیوس انکوبه مینمائیم

برای اطلاعات بیشتر در این زمینه به قسمت وبلاگ مبحث استخراج RNA مراجعه فرمایید.

print

Tags: , , ,


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

13 − هشت =