استخراج RNA با استفاده از RNA X PLUS

مواد لازم:
RNA xPLUS
کلروفرم
ایزوپروپانول
اتانول ۷۵ %
PBS استریل
ویال های ۵/۱ میلی لیتری اتو کلاو شده
روش کار:
۱- ابتدا سلول ها را از کف فلاسک يا پليت با تريپسينه کردن جدا و با سانتريفيوژ رسوب داده میشوند. سپس مقدار ۱mlاز محلول RNX-Plus را به نمونه سلولي اضافه میگردد.
۲- مخلوط RNX-Plus و سلول را به يک ويال ۱٫۵mlيا ۲mlانتقال می دهیم.
۳- اين مخلوط را به مدت ۵ الي ۱۰ ثانيه به خوبي با ورتکس کردن هموژن کرده و به مدت min 5 در دماي اتاق انکوبه میکنیم.
۴- مقدار ۲۰۰ لاندا کلروفرم به ويال اضافه می گردد.
۵- به مدت ۱۵ ثانيه محتويات ويال را با تکان دادن به خوبي مخلوط می کنیم(نبايد ورتکس گردد).
۶- سپس ويال را به مدت ۵-۱۰minروي يخ انکوبه میشود.
۷- پس از آن، ويال را در دماي ۴’C با دور rpm 13000-12000 به مدت۱۵-۳۰min سانتريفيوژ می کنیم.
۸- در اين مرحله ۳ فاز ايجاد شد: ۱- فاز آبي بالايي شامل RNA بود، ۲- فاز سفيدرنگ مياني پروتئين است و ۳- فاز پاييني شامل DNA و فنول است. با احتياط به گونه اي که فاز مياني برداشته نشود، فاز آبي بالايي را برداشته شده و به يک ويال ۱٫۵ml جديد عاري از RNase انتقال می گردد.
۹- هم حجم با حجم فاز آبي، ايزوپروپانول به ويال اضافه می شود.
۱۰- ويال را به شدت تکان داده شد تا محتويات با هم مخلوط شوند و سپس آن را به مدت ۱۵-۳۰ min روي يخ يا در دماي -۲۰ (به منظور رسوب دادن هر چه بيشتر RNA ) انکوبه میشود.
۱۱- سپس ويال را به مدت ۱۵-۳۰min در دماي ۴ درجه سانتیگراد با دور rpm 12000 سانتريفيوژ میگردد.
۱۲- محلول رويي دور ريخته شد و رسوب را، که شامل RNA است، در۱ml اتانول ۷۵% با کمي ورتکس کردن حل می شود. (البته در اين مرحله رسوب کاملا در اتانول حل نميشود، فقط از کف ويال جدا ميشود و هدف از اين مرحله فقط آبگيري بيشتر از RNA است.)
۱۳- سپس ويال را به مدت ۱۰-۱۵ min در دماي ۴ درجه سانتیگراد با دور rpm 12000 سانتريفيوژمی کنیم.
۱۴- محلول رويي را دور ريخته شد و رسوب در دماي اتاق براي چند دقيقه انكوبه شد تا الکل آن بخار شده و خشک شود.( رسوب نبايد بيش از حد خشک شود، وگرنه حلاليت آن در آب کاهش مي يابد.)
۱۵- بر حسب ميزان رسوب و ميزان سلولي که از آن استخراج RNA شده، رسوب را در۲۰-۵۰ لاندا از آب DEPC حلمی شود.( براي حل شدن بهتر و راحت تر رسوب، مي توان آب DEPC را از قبل در دماي ۵۵-۶۰درجه سانتیگراد قرار داد و سپس به رسوب اضافه کرد يا مخلوط آب و RNA را به مدت چند دقيقه در دماي ۵۵-۶۰ درجه سانتیگراد قرار داد).

ارزیابی و تعیین خلوص و کیفیت RNA ی استخراج شده:
ارزیابی کمی:
یکی از راه های تعیین کمیت و کیفیت RNA استخراج شده استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر نانو دراپ یا پیکو دراپ می باشد که در سال ۱۹۹۸ توسط دکتر چارلز رابرتسون اختراع گردید. این دستگاه می تواند با استفاده از غلظت های کم نمونه، با سرعت زیاد، غلظت های مختلف نمونه را بخواند.
اين روش بر مبناي جذب نوري در طول موجهاي ۲۳۰، ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر تنظیم می‌شود. طول موج ۲۳۰ مربوط به آلودگي به فنول، اتانول و ايزوپروپانول، طول موج ۲۶۰ مربوط به RNA و DNAبيشترين جذب را در طول موج ۲۶۰ دارد و پروتئين بيشترين جذب را در طول موج ۲۸۰ نانومتر دارد. در شرايط ايده آل بايستي ميزان آلودگي با پروتئين، فنل و اتانول بسيار کم باشد. به عبارت ديگر بايستي نسبت طول موج ۲۳۰/۲۶۰ بالاتر از ۱ و در حدود۸/۱ الي ۲ باشد، مقادير پايينتر از ۱ نامطلوب است و بهتر است بر روي چنين نمونه¬اي کار نشود. همچنين نسبت طول موج ۲۸۰/۲۶۰ نيز بايد حدود ۸/۱ الي ۲ باشد و نسبت¬هاي کمتر از ۵/۱ جهت ادامه کار مناسب نيستند.
قابل ذکر است که در صورت استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومتر، غلظت با استفاده از رابطه زیر محاسبه می شود:

C ( g/ml ) = A260  × d/1000
C: غلظت
A260: جذب نوری در طول موج ۲۶۰
: ضریب خاموشی مولی برای RNA برابر ۴۰ و برای DNA برابر ۵۰
d: ضریب رقت
منحنی تعیین خلوص RNA

ارزیابی کیفی:
یکی از راه های مشاهده ی کیفیت RNA استخراج شده ، Run کردن RNA روی ژل آگازور است. جهت ساخت ژل آگازور از بافر TBE استفاده می شود. برای ساخت ۲۰۰ ml بافر TBE ، ابتدا به ۱۵۰ میلی لیتر آب مقطعر، ۹/۱۰ گرم تریس ـ باز، ۵۶/۵ گرم بوریک اسید و ۷۴/۰ گرم EDTA اضافه کرده و پس از همزدن با مگنت مغناطیسی به PH 8 می رسانیم. سپس حجم نهایی به ۲۰۰ میلی لیتر رسانده می شود. این TBE X5 بوده و برای هربار استفاده از آن باید آن را X1 کنیم.
۱٫ براي تهيه ژل، ابتدا ميزان ۱ گرم آگارز را وزن كرده و در مقدار ۱۰۰ ميليليتر بافر TAE1X حل ميگردد.
۲٫ پس از خنك شدن ژل، بطوريكه از آن بخاري متصاعد نشود (حدود ۶۰ درجه سانتيگراد) به ازاي هر ۱۰ ميليليتر ژل ۰٫۱ ميكروليتر اتيديوم برومايد (۰٫۵ mg/ml) به آن اضافه شد.
۳٫ شانه مناسب با الكل ۷۰ درصد تميز شده در قالب قرار گرفت و قبل از سرد شدن ژل و بستن، آن را در قالب مخصوص ژل كه شانه ايجاد چاهك در آن قرار داده شده ريخته و پس از بستن ژل شانه خارج و ژل درون تانك الكتروفورز حاوي بافر TAE1x قرار داده ميشود.
۴٫ پس از تهيه ژل به هر يك از ميكروتيوپها حاوي محصول ۲٫۵PCR ميكروليتر بافر بارگذاري (Loading)10x اضافه و به آرامي مخلوط ميگردد.
۵٫ سپس با دقت نمونهها را به ترتيب مشخص به چاهكهاي ژل در قطب منفي انتقال داده شد.
۶٫ همراه با محصولات PCR در يكي از چاهكها ۴ ميكروليتر شاخص تعيين اندازه مولكولي ۱۰۰kb DNA (DNA size Marker)ريخته شد.
۷٫ پس از انتفال نمونهها برروي ژل، الكتروفورز با ولتاژ ۱۵۰ ولت، به مدت ۲۵ دقيقه انجام شد.
۸٫ پس از انجام الكتروفورز، با تاباندن نور ماوراء بنفش توسط دستگاه UV Transleminator باندهاي ايجاد شده مشاهده و تفسير گرديد.

RNA ای که خلوص بالایی دارد دو باند واضح بر روی ژل ایجاد می کند. برای خواندن و مشاهده ی باندها باید ژل پس از Run شدن داخل اتیدیوم روماید شود و سپس در دستگاه مخصوص زیر نوع UV خوانده شود. از ۲ باند مشاهده شده ی هر RNA یکی مربوط به ۲۸S rRNA است که به دلیل اینکه طول بیشتری دارد در بالا قرار می گیرد و دیگری باند ۱۸S rRNA است که چون طول کمتری دارد در پائین ژل می باشد.

برای اطلاعات بیشتر و توضیحات دقیق تر در این زمینه به قسمت وبلاگ مبحث استخراج RNA مراجعه فرمایید.

print

Tags: ,


۱ دیدگاه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

یازده − 1 =