بررسی بیان ژن با تکنیک REAL TIME PCR

اساس Real time PCR
PCR معمولی از نظر تعیین وجود یا عدم وجود توالی خاص بسیار کارا محسوب می شود. مشکل زمانی بروز می کند که هدف تعیین میزان اولیه مولکول الگو با در واقع قیاس کمی (Quantitative) بین نمونه های مختلف باشد. علت این امر ناشی از دو عامل نحوه پردازش داده ها در PCR و ماهیت PCR است :
۱-پردازش داده ها در PCR : در انتهای PCR محصول DNA بدست آمده، به شیوه های مختلفی تیمار شده و اطلاعات مورد نظر از آن بدست می آید. در اغلب موارد این عمل با راندن محصول بر ژل آگارز انجام می گیرد. اگر هدف از PCR مقایسه کمی میان نمونه ها باشد، در این صورت می توان با مقایسه شدت باندهای حاصله بر ژل آگارز به میزان اولیه در نمونه ها پی برد. زیرا هر چه میزان اولیه بیشتر باشد محصول بیشتر و باند قویتری خواهیم داشت. با این حال محدودیت های حاکم بر ژل آگارز موجب ایجاد خطاهای عمده در نتایج خواهد شد. تعدادی از این محدودیت ها عبارتند از:
۱-حساسیت پایین ژل آگارز.
۲-تمایز تنها بر اساس اندازه قطعات صورت می گیرد.
۳-رنگ اتیدیوم بروماید با کارایی یکسانی به توالی ها وصل نمی شود.
۴-نتایج به صورت عدد بیان نمی شود.
۵-غلظت دو باند بیش از دو لگاریتم (بیش از ۱۰۰ برابر) با هم اختلاف داشته باشند تا کاملا قابل تفکیک باشد.

انواع روش ها در Real Time PCR
روش های موجود در Real Time بسیار متعدد بوده که عموماً براساس پروب های فلوئورسانس مورد استفاده در آنها مورد تقسیم قرار می گیرند:
پروپ های فلوئورسانت معمول سه مورد زیر هستند:
رنگ های متصل شونده به DNA که می توان موارد زیر را برای آن نام برد:
الف. اتیدیوم بروماید که فوق العاده سمی و سرطان زا است.
ب. رنگ های سیانین و نا متقارن که در حلقه ی آروماتیک حاوی نیتروژن هستند از این گروه می توان به سایبرگرین۱ اشاره کرد. سمیت این گروه نسبت به گروه قبل کمتر است.
پ. LC Green-CYTO و …که نسبت به دو گروه قبل سمیت کمتری دارد.
پروب های هیدرولیزی مانند پروب های ۵^’ نوکلئازی مثل Taq man
پروب های هیبریدی مانند FRET
پروب های بازآرایی مانند روش مولکولی بیکون

انجام Real Time PCR با استفاده از سایبرگرین:
سایبرگرین ۱، یک ماده ی فلورسنت متصل شونده به شیار کوچک مارپیچ دورشته ای DNA است. با افزایش مقدار DNA محصول ، ضمن PCR، سایبرگرین ۱ بیشتری به آن متصل شده و میزان فلورسانس افزایش خواهد یافت. میزان فلورسانس با مقدار مولکول های دو رشته ای DNA ی تولیدی متناسب خواهد بود و از این طریق می توان میزان تکثیر را طی زمان و از طریق اندازه گیری فلوئورسانس درهرچرخه بررسی نمود. (لازم به یادآوری است که سایبرگرین ۱ به DNA ی تک رشته متصل نمی شود پس این ماده در مرحله ی Denaturation به DNA نمی چسبد بلکه در مراحل annealing و extension و همزمان با دورشته ای شدن دو مولکول DNA، در ساختار آن قرار می گیرد). سایبرگرین هنگامی که به مولکول DNA ی دورشته ای متصل باشد نور را در طول موج ۴۸۰ نانومتر جذب و در طول ۵۲۰ نانومتر منتشر می شود.
سایبرگرین ۱ نسبت به سایرپروب ها یکسری مزایا دارد که از بین آنها می توان به موارد زیر اشاره کرد:
بدلیل غیراختصاصی بودن به هر نوع DNA دو رشته ی متصل می شود پس می توان از آن برای نمایش دادن هر ژنی استفاده کرد.
نسبت به سایر پروب ها ارزان تر و کاربردآن آسانتر است.
حساسیت آن نسبت به سایر پروب ها بیشتر می باشد.
نسبت به دما پایدار است و با آنزیم DNA پلی مراز تداخل ندارد.
اگرچه استفاده از سایبرگرین ۱ با توجه به مزایای ذکر شده بسیار متداول است اما چون این ماده می تواند به صورت غیر اختصاصی به هر DNA دورشته ای متصل شود پس می تواند علاوه بر اتصال به DNA ی مورد نظر به پرایمر و سایر دورشته های غیراختصاصی هم اتصال یابد که این مورد یک عیب برای سایبرگرین ۱ محسوب می شود. برای بهینه سازی کار باید به نحوی عمل کرد که حداقل محصولات غیر اختصاصی و پرایمر دایمر ایجاد شود. هم چنین استفاده از آنالیز منحنی ذوب هم در حل این مسئله کمک می کند.

منحنی ذوب با افزایش تدریجی حرارت از دمایی پائین تر از نقطه ی ذوب محصولات، شروع شده و تا دمایی بالاتر از نقطه ی ذوب آنها ادامه می یابد. دامنه ی تغییرات دمایی در رسم منحنی ذوب توسط کاربران، قابل تنظیم است. محصولات تکثیر شده در دماهای متفاوتی براساس طول قطعه تکثیری و میزان گوانین ـ سیتوزین آنها، ذوب (دناتوره) خواهند شد. هنگامی که محصولات ذوب (دناتوره) شدند، میزان فلورسانس کاهش یافته و توسط دستگاه اندازه گیری می گردد. سپس پیک های ذوب را می توان از طریق تفکیک و تفاوت منحنی ذوب محاسبه نمود. پیک های ذوب بیانگر محصولات تکثیر شده طی واکنش هستند. این پیک ها مشابه باندهای ایجاد شده در ژل الکتروفورز می باشد. پس داده های منحنی ذوب به طور کیفی منجر به نمایش محصولات تکثیر شده در پایان آزمایش سایبرگرین می گردد.

انجام Real Time PCR با استفاده از پروب های هیدرولیز :
در این روش از خاصیت اگزونوکلئازی ۳^’ → ۵^’ آنزیم Taq پلیمراز استفاده می گردد. پروب های هیبرید در این مدل طوری طراحی شده اند که هردوانتها (۵^’ فلوئوروکروم Reporter و ۳^’ فلورو ئوکروم Quencher) توسط رنگ های فلوئورسنت، نشان دار گشته اند.
در این مدل، هنگامی که پروب سالم و دست نخورده باشد به دلیل نزدیکی Quencher به Reporter و استفاده از انتقال انرژی رزونانس (FRET) ، از ساطع شدن فلوئورسانس فلوئوکروم Reporter جلوگیری می گردد. هنگام تکثیر توالی هدف و در فاز پلیمریزاسیون، پروب به وسیله ی Taq پلیمراز از DNA جدا شده و به واسطه ی فعالیت اگزونوکلئازی ۵^’ → ۳^’ آنزیم Taq پلیمراز هیدرولیز می گردد. با هیدرولیز پروب، فلوئوروکروم Reporter و Quencher از یکدیگر جدا شده و این عمل منجر به ساطع شدن فلوئورسانس Reporter و شناسایی می شود. با افزایش سیکل های PCR ، مولکول های بیشتری از فلوئوروکروم Reporter جدا می گردد و میزان فلوئورسانس نیز متعاقب آن افزایش می یابد. حال فلوئورسانس ساطع شده توسط دستگاه شناسایی و اندازه گیری می شود.

انجام Real Time PCR با استفاده از پروب های هیبریداسیون:
در این روش از دو پروب اختصاصی مربوط به توالی هدف استفاده می شود. هر دو پروب با رنگ های فلوئورسنت نشان دار شده اند (انتهای ۳^’ فلوئوروکروم Donor و انتهای ۵^’ فلوئوروکروم Acceptor). پروب ها به توالی مجاور هم در DNA تکثیر شده متصل می شوند. اتصال پروب ها به توالی هدف در DNA تکثیر شده سبب می شود تا دوپروب درفاصله ی ۱ تا ۵ نوکلئوتیدی نزدیک به هم قرار گیرند. این امر سبب می شود تا فلوئوروکروم Donor برانگیخته گردد و نور را با طول موج بلندتر ساطع کند. به واسطه ی انتقال انرژی رزونانس فلوئورسانس، فلوئوروکروم Acceptor نیز برانگیخته می گردد و فلوئورسانس قابل شناسایی برای دستگاه ساطع می شود. فلوئورسانس ساطع شده در مرحله annealing و در ابتدای مرحله extension شناسایی می گردد. با افزایش سیکل موفق PCR میزان annealing پروب افزایش می یابد که این امر موجب افزایش فلوئورسانس ساطع شده می گردد.

انجام Real Time PCR با استفاده از روش molecular Beacons
در این روش، مطابق روش های قبلی از یک توالی اولیگونوکلئوتیدی مکمل با بخشی از توالی DNA ی هدف که دارای یک رنگ فلوئورسانت و یک رنگ خاموش کننده است، استفاده می شود. این توالی اولیگو ـ نوکلئوتیدی به گونه ای طراحی می گردد که چند نوکلئوتید در انتهای ۵^’ و ۳^’ آن مکمل یکدیگر باشند و ساختار سنجاق سری ایجاد کنند. در این حالت دو رنگ فلوئورسنت و خاموش کننده در کناریکدیگر قرار می گیرند و در نتیجه ی اثر FRET ، طول موج تابش شده توسط رنگ فلوئورسانت به وسیله ی خاموش کننده جذب می گردد. در مرحله ی annealing ، این پروب به DNA ی هدف متصل می شود و دورنگ از یک دیگر دور می شوند و در نتیجه اثر FRET از بین رفته و نور تابش شده از رنگ فلوئورسنت توسط دستگاه گزارش می شود.
در طول مدت PCR ، molecular Beacons دست نخورده باقی مانده و تنها در هر سیکل واکنش PCR به توالی هدف متصل می شود.

بررسی دستگاه Real Time PCR:
این دستگاه از سه قسمت اصلی منبع نور، سیستم آشکارساز و ترموسایکلر تشکیل می شود. سیستم آشکار ساز طیف نوری و حساسیت هر نمونه ی آزمایشی را مشخص می کند و ترموسایکلر سرعت انجام هر آزمایش را مشخص می کند و نیز تغییرات دمایی از یک ویال به ویال دیگر را ثابت نگه می دارد.
در حین عمل PCR ، هر میکروتیوپ در محفظه ای از جریان هوا در حال چرخش است تا تمام میکروتیوپ ها کاملاً در دمای یکسای قرار بگیرند. زمانی که هر میکروتیوپ در مقابل آشکار ساز نوری قرار می گیرد نمونه ی موجود در هر ویال از خود پرتو ساطع می کند و سیگنال فلوئور سانت به طور پی در پی توسط یک مسیر کوتاه نوری جمع آوری می گردد؛ یکنواختی نوری و حرارتی باعث افزایش میزان حساسیت، دقت و سرعت آنالیز Real Time PCR می شود. هم چنین سبب حذف نوسانات حرارتی بین یک نمونه به نمونه ی دیگر می گردد که در ترموسایکلر بر پایه بلوک اجتناب ناپذیر است.
در ابتدا نور ساطع شده بر روی فیلتر متمرکز گردیده و سیگنال حاصل از آن به آشکارساز PMT می رسد. میکروتیوپ ها به سمت تنها مسیر نوری با سرعت ۴۰۰ rpm دور در حرکتند و آشکارسازی Real Time در چند هزارم ثانیه صورت می گیرد.

بررسی منحنی آمپلیکاسیون Real Time PCR :
این منحنی به طور کلی از ۴ فاز تشکیل می شود:
فاز مبنا: نام دیگر آن فاز زودرس است. در این فاز همانندسازی DNA به صورت تصاعدی است اما میزان نور فلوئورسانس ساطع شده زیر حد آستانه ی تشخیص فیلترهای دستگاه PCR است.
فاز نمایی : به آن فاز پیشرونده یا لگاریتمی هم می گویند. در این فاز تکثیر مولکول های DNA به صورت تصاعدی بوده و میزان فلوئورسانس تولیدی هم درحال افزایش است. این میزان فلوئورسانس توسط دستگاه PCR قابل شناسایی است.
فاز خطی : در این فاز تکثیر DNA از لحاظ سرعتی کاهش می یابد. این کاهش دلیلی بر کاهش شیب منحنی می باشد.
فاز پلاتو : نام دیگر آن فاز سکون است. در این فاز تکثیر متوقف می شود که می توان از دلایل آن به محدود شدن آنزیم، کاهش مواد موجود در واکنش و یا اتصال مجدد محصول PCR و رقابتِ آنها با هیبریداسیون پروب ها اشاره کرد.

بررسی مزایای Real Time PCR:
امکان مشاهده ی لحظه به لحظه ی واکنش فراهم است و در هر سیکل امکان مشاهده و بررسی تکثیر DNA وجود دارد در حالیکه در متدهای مرسوم PCR ، تولید محصول را فقط در پایان کار می توان دید.
امکان قطع واکنش در زمان دلخواه وجود دارد. با توجه به اینکه روند PCR قابل مشاهده است، در صورت بروز هرگونه مشکل از جمله عدم تکثیر یا ورود به فاز سکون می توان برای جلوگیری از اتلاف وقت و انرژی واکنش را خاتمه داد.
محدوده ی تشخیص آن بالاتر از PCR های معمولی است. حتی اختلاف کمتر از دوبرابر را هم نشان می دهد. این مزیت امکان بررسی نتایج به صورت دقیق (کمیت سنجی مطلق) ونسبی (کمیت سنجی نسبی) را فراهم می کند.

آنالیز داده های Real Time PCR:
به طور کلی ۲ روش برای آنالیز داده ها در دستگاه Real Time PCR وجود دارد:
۱٫کمیت سنجی مطلق

۲٫کمیت سنجی نسبی
با توجه به هدف مطالعه و آنالیز داده ها و نوع کاربردها یکی از دوروش ذکر شده انتخاب می شود.

کمیت سنجی مطلق:
در این روش ارزیابی نمونه های مجهول را با منحنی استاندارد مقایسه می کنند. منحنی استاندارد منحنی ای است که براساس رقت های مختلف CDNA و PCR آنها ایجاد می شود. از DNA معلوم با غلظت مشخص به عنوان استاندارد استفاده می گردد. در این روش تعداد دقیق نسخه های حاصل از یک ژن مشخص می شود.

کمیت سنجی نسبی :
در این نوع آنالیز دو یا چند ژن را با یکدیگر و به صورت تناسبی مقایسه می کنیم. این نوع آنالیز در حال حاضر دقیق ترین روش برای بررسی تغییرات بیان ژن ها است. لازم به توضیح است که در این آنالیز تعداد ژن ها مهم نیست بلکه کاهش یا افزایش بیان ژن ها اهمیت دارد.

برای آنالیز نمونه ها، باید شماره سیکلی که در آن PCR وارد فاز لگاریتمی می شود را محاسبه نمود. این سیکل اصطلاحا، سیکل آستانه (Threshold cycle) گفته می شود. سیکل Ct سیکلی است که در آن میزان فلورسانس محصولات از یک حد آستانه بیشتر می شود. برای مقایسه میزان اولیه نمونه ها میزان Ct نمونه ها با یکدیگر مقایسه می شود. مقدار کمی بیان یک ژن را می توان یا با استفاده از منحنی استاندارد و یا با مقایسه Ct اندازه گرفت. در روش مقایسه Ct بایستی مقدار بازده تکثیر ژن هدف و ژن رفرانس نزدیک به یکدیگر باشد.
منحنی Real time PCR. سطح آستانه که بالاتر از میزان فلورسنس پایه است موجب مشخص شدن Ct هر منحنی می گردد.

در روش انداره گیری بیان بر مبنای روش آنالیز نسبی، تغییرات بیان ژن هدف نسبت به یک ژن بیان ثابت (ژن رفرنس) اندازه گیری می شود. بنابرین بیان ثابت ژن رفرنس از اهمیت بالایی بر خوردار است. در این رابطه چندین الگوریتم برای شناسایی ژن رفرنس مناسب طراحی شده است. از طرفی بر اساس کینتیک PCR چندین مدل ریاضی برای اندازه گیری بیان ژن تعریف شده است. این مدلها عمدتا مبتنی بر اندازه گیری و مقایسه مقدارCp یا CT ژن های بیان ثابت و ژن هدف قبل و بعد از اعمال تیمار است.
استراتژی های متفاوتی برای تحلیل داده های کمی Real time PCR وجود دارد. روشی که در اکثر تحقیقات در پیش گرفته میشود روش کمیت سنجی نسبی (Relative quantification) است. در این روش به منظور رفع خطاهای PCR و ارتقا اطمینان به داده های بدست آمده، از یک کنترل درونی برای نرمال ساختن داده ها سود برده می شود. این کنترل درونی یک ژن خانه دار (Housekeeping gene) می باشد. ژن های خانه دار، ژن هایی هستند نه در تمامی بافت ها در سطح پایه و به طور ثابت بیان می شوند مانند ژن های GAPDH و یا ACTIN و …..
پس از انجام واکنش Real Time PCR و پردازش اطلاعات حاصل از منحنی های استاندارد و محاسبه مقادیر Cp یا CT ژن های بیان ثابت و ژن هدف می توان از یکی از روشهای زیر استفاده کرد:
روش CT∆∆ (Livak and schmiugen 2001) 2-
روش پی فافل (Pfaffl)(Pfaffl, Horgan et al.2002)

روشCT ∆∆ ۲-
در این روش فرض بر این است که هم ژن مورد نظر و هم ژن رفرنس با کارایی نزدیک به ۱۰۰% درون دستگاه Real Time PCR تکثیر می شوند. پیش از استفاده از روش ۲-∆∆CT لازم است که فرض ۱۰۰% بودن کارایی دستگاه برای ژن های مورد نظر و ژن رفرنس تعیین شود که این با رسم منحنی استاندارد مشخص می شود. اگر ژن های هدف و ژن رفرنس با کارایی نزدیک به ۱۰۰% تکثیر می شوند، می توان با استفاده از فرمول های زیر تفاوت در بیان ژن های مورد نظر و ژن رفرنس را تعیین کرد.
CT(Sample A) = CT(Gene of interest)-CT (internal control))
CT (sample B) = CT (Gene of interest)-CT (internal control))∆
Fold change = 2-∆∆CT

با این حال اگر ژن های مورد نظر و ژن های بیان ثابت بازدهی تکثیر مشابه نداشته باشند، می بایست که شرایط آزمایش را مجددا بهسازی کرد و یا اینکه از روش پی فافل استفاده کرد.

روش پی فافل
محاسبه بیان ژن با استفاده از روش ۲-∆∆CT تنها زمانی معتبر است که کارایی تکثیر ژن های مورد نظر و بیان ثابت همانند هم و نزدیک به ۱۰۰% باشند. اگر کارایی تکثیر ژن های مورد نظر و بیان ثابت همانند هم نباشند باید از معادله پی فافل برای محاسبه بیان نسبی ژن های مورد نظر و بیان ثابت در نمونه های آزمایشی استفاده کرد.
فرم نهایی معادله پی فافل به صورت زیر می باشد
Fold difference = (E target) ΔCt target /(E normalizer)ΔCt normalizer
E = efficiency from standard curve E = 10[-1 /slope]
ΔCt target = Ct GOI c – Ct GOI s
ΔCt normalizer = Ct norm c- Ct norm s

روش برآورد کارایی تکثیر
به طور کلی برآورد کارایی تکثیر با دو روش انجام می شود. در روش معمول کارایی از طریق اطلاعات حاصل از منحنی استاندارد برآورد می شود که فرمول این روش به صورت زیر می باشد:
Efficiency = [10(-1/slope)]-1

در روش دوم از اطلاعات خام حاصل از واکنش PCR جهت برآورد کارایی و تکثیر و همچنین از اطلاعات حاصل از فاز نمایی تکثیر PCR استفاده می شود. این روش فرمولهای متعددی بوده و در برخی از تحقیقات این روش دقت بیشتری نسبت به روش منحنی استاندارد داشت. چندین نرم افزار برای برآورد کارایی تکثیر با این روش طراحی شده است که یکی از نرم افزارها Linreg می باشد، از این نرم افزار جهت برآورد کارایی تکثیر و عدد Ct استفاده می شود . سپس تغييرات بياني ژنهاي مورد مطالعه با استفاده از خروجي Linreg توسط نرم افزار) REST (Relative Expression Software Toolبراساس روش Pair Wise Fixed Reallocation Randomization Test بررسي میگردد.

برنامه ی زمانی و دمایی Real Time PCR:
به طور کلی مراحل PCR شامل ۳ مرحله ی Denaturation ، Annealing و Extension است. مرحله ی دناتوراسیون بیشترین دمای ممکن را می طلبد دمای واکنش در این مرحله بسته به نوع ژن بین〖۹۰〗^(°C) تا 〖۹۵〗^(°C) متغیر است. مدت زمان این مرحله ۱۵ ثانیه می باشد. دمای لازم برای چسبیدن دو رشته بین 〖۶۰〗^(°C) تا 〖۶۱〗^(°C) در زمان ۲۵ ثانیه می باشد. مرحله ی آخر طویل سازی می باشد که در این مرحله دمای واکنش 〖۷۲〗^(°C) در زمان ۳۰ ثانیه است. این چرخه دائماً در حال تکرار است تا مقدار DNA مورد نظر فراهم شود.
معمولاً قبل از سه مرحله ی بالا یک مرحله ی Initial Denaturation هم وجود دارد که DNA را برای جداسازی آماده می کند. دما در این مرحله 〖۹۵〗^(°C) و زمان لازم ۵ ثانیه است.
مهمترین و سخت ترین مرحله ی REAL TIME ست اپ کردن دماها و مدت زمان مراحل مختلف PCR است که برای انواع مختلف ژن ها متفاوت می باشد و تنظیم ان ممکن است هفته ها یا ماهها طول بکشد.

وسایل واکنش Real time RT-PCR

لوله های مویینه Capillary tube و Cap ، سانتریفیوژ، Cool box، میکروتیوپ ۵/۰ ، ست سمپلر و سر سمپلر، دستگاه rotor gene و کیت مربوط به تکنیک real time
مواد واكنش
مستر ميكس
پرايمر رفت
پرايمر برگشت
C DNA
اب
واکنش های Real-Time PCR در حجم کلی ۱۰ میکرولیتر آماده سازی میشوند. به این منظور ابتدا به میزان ۵ میکرولیتر از SYBR® Green Master درون ویال ۱/۰ میلی لیتری RNase free ریخته شد و سپس، ۱ میکرولیتر از پرایمرهای بالادست و پایین دست ویژه هر ژن با غلظت نهایی ۳۰۰ نانومولار به آن اضافه میگردد. در انتها، ۴ میکرولیتر از cDNA که با آب RNase free و DNase free رقیق شده است به هر میکروتیوب اضافه شده. ویال ها به دستگاه Rotor Gene-6000 Real-Time analyzer منتقل میگردد. واکنش های PCR در شرایط دمایی و زمانی خاص بر اساس نوع ژن و در طی ۴۵ سیکل انجام شد

کیت های متعددی برای تکنیک REAL TIME وجود دارد که میتوان بر اساس دستور العمل نوشته شده درون آن، از مقادیر متنوعی از اجزای بالا استفاده کرد.

print
Tags: , , , , , , , , ,


2 دیدگاه

  • فرشته بافنده says:

    سلام وقت بخیر
    من این متن رو میخواستم اگر امکانش هست برام ایمیل بفرمایید ذخیره و یا دانلود نشد.
    ممنون

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

8 − پنج =