جدا سازی و کشت سلول های اپیتلیال شبکه کوروئید از مغز رت

موشهای صحرایی(رت) نر و ماده بالغ توسط گاز CO2 در دسیکاتورکشته شدند، مغزشان جدا شده و به درون لوله های حاوی محیط کشت و آنتی بیوتیک منتقلمی شوند. در زیر یک میکروسکوپ تشریح، در قسمت لوب آهیانه مغز یک برش کرونال زده شده و با کمک یک پنس ظریف ، بافت شبکه کوروئید از بطن های طرفی و بطن سوم خارج شده و به درون لوله فالکون حاوی محیط کشت و آنتی بیوتیک منتقل می شود. پس از شستشو، بافتها به درون لوله حاوی تریپسین % ۲۵/. منتقل شده و به مدت ۳۰ دقیقه و در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد اینکوبه می گردد. هر ۱۰ دقیقه یکبار بافتها پیپت شدند و در نهایت پس از اینکه بافتها کاملا توسط آنزیم هضم شده، به درون لوله، سرم FBS افزوده شده تا فرایند هضم شدن خنثی شود. سپس نمونه ها در دور ۱۵۰۰ سانتریفیوژ شده و پس از حذف محیط روئی، رسوب سلولی به فلاسک های کشت T25 حاوی محیط کشت DMEM/F12 به همراه ۱۰ درصد سرم FBS و آنتی بیوتیک(ونکومایسین) ۱۰ ng/mL منتقلمی شوند. پس از ۴۸ ساعت، محیط کشت تعویض شده و به آن سرم و Ara C با غلظت ۲۰ میکرو مولار اضافه می شود. سلولها به مدت یک هفته با Ara C که یک مهار کننده میتوزی است و سبب مهار رشد سلول هایی با قدرت تقسیم بالا می شود، اینکوبهخواهد شد. از آنجایی که بافت شبکه کوروئید حاوی اجزای بافت همبندی نیز است در نتیجه همراه سلول های اپیتلیال شبکه کوروئید معمولا آلودگی فیبروبلاستی نیز دیده می شود و از طرفی سرعت رشد فیبروبلاستها بیشتر از CPECs بوده، در نتیجه Ara C قادر به مهار رشد فیبروبلاستها میباشد. پس از آن هر ۳ روز یک بار محیط کشت سلولها تعویض و رشد سلولها روزانه با میکروسکوپ نوری دنبال می شوند. CPECs پس از رسیدن به یک تراکم مناسب با تریپسین پاساژ داده شده و به ظرفهای جدید منتقل میشوند.

print
Tags: , ,


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

12 − دو =