اندازه گیری میزان سیتوتوکسیسیتی توسط تست رنگ سنجیMTT

روش های متعددی جهت سنجش غیر مستقیم میزان تکثیر و زنده ماندن سلول ها وجود دارد. اغلب این روش ها میزان فعالیت یک آنزیم سلولی را درون سلول زنده اندازه گیری می کند. یکی از شناخته شده ترین این روش ها تست رنگ سنجی MTT است. این تست برای اندازه گیری میزان تکثیر سلول ها در مواجه با عوامل مختلف و تعیین میزان سمیت این عوامل هنگامی که بر روی سلول ها اثر داده می شود کاربرد دارد. درواقع از این تکنیک برای تعیین میزان سمیت یک داروی خاص کمک می گیرند.

تست MTT از روش های کلورومتریک بوده که این روش مرگ سلولی را تخمین می زند و می تواند مرگ سلول را در مراحل خیلی دیر آپاپتوسیس، وقتی متابولیسم سلولی در حال افت است، تشخیص می دهد. این تکنیک اولین بار در سال ۱۹۸۳ توسط mosmann مورد استفاده گردید.
نام این تکنیک برگرفته شده از نام ماده ای با فرمول مولکولی C18 H16 BrN5 S و نام علمی: ۳-[۴,۵-Dimethyl thiazol-2-yl]-2,5 phenyltetrazolivm brimide
می باشد. این ماده به صورت پودری بوده که به شدت به نور حساس می باشد. هنگام استفاده باید با مقدار مناسبی PBS ترکیب شود و به صورت محلول دربیاید. این محلول زرد رنگ بوده و به دلیل داشتن بار مثبت خالص و پتانسیل غشا جذب سلول می شود و از طریق روش اندوسیتوز وارد سلول ها شده و به میتو کندری می رود، سپس در آنجا توسط آنزیم سوکسینات دهیدروژناز میتوکندری که فقط در زنجیره ی تنفسی سلول زنده فعال است به رسوب های بنفش غیر قابل حل در آب تبدیل می شود. لازم به ذکر است که فقط سلول های زنده می توانند محلولMTT را به یک رسوب فرومازون بنفش غیر محلول در آب تبدیل کنند. کریستال فرومازون قادر به عبور از غشای سلول ها نیستند. این کریستال های بنفش رنگ در حلال های آلی به فرم محلول در می آیند. معمولاً DMSO و SDS در اسید هیدروکلریک رقیق به عنوان حلال مورد استفاده قرار می گیرند. ایزوپروپانول نیز حلال بسیار خوبی برای فرمازان است اما به علت گرانی کمتر مورد استفاده قرار می گیرد.
تراکم نوری محلول حاصل را می توان با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج ۵۷۹ نانومتر با طول موج مبنای ۶۳۰ نانومتر اندازه گیری کرد. باتوجه به اینکه واکنش احیای MTT به فرومازون فقط در سلول های زنده رخ می دهد که دارای آنزیم دهیدروژناز فعال هستند پس مقدار عددی به دست آمده توسط این تکنیک به طور مستقیم با تعداد سلول های زنده در ارتباط است. در این سنجش میزان فرومازان تولید شده توسط سلول های تیمار شده با داروی خاص را با میزان فرمازان تولید شده توسط سلول های شاهد که دارویی دریافت نکرده اند مقایسه می کنند و از این مقایسه میزان اثر آن عامل خاص را روی مرگ و مهار رشد سلول ها تعیین می نمایند. هرچه میزان جذب خوانده شده نسبت به حالت کنترل کمتر باشد می توان نتیجه گرفت که تعداد سلول های زنده کم شده و مهار رشد بیشتری صورت گرفته است.

روش انجام تست MTT :
برای انجام تست MTT به پنج روز متوالی نیاز است.
در روز اول ابتدا یک سوسپانسیون سلولی از سلول ها تهیه شده و پس از شمارش با لام نئوبار در پلیت های ۹۶ خانه کاشته می شود. در هر خانه این پلیت ۱۰۰ μL از سوسپانسیون سلولی ریخته می شود. در هنگام کاشت باید دقت شود که محلول همگن باشد تا تراکم سلول در همه ی خانه ها به یک اندازه باشد. در تست MTTمیزان تأثیر دارو روی سلول در ۳ فاصله ی زمانی ۲۴، ۴۸ و ۷۲ بررسی می شود. پس برای هر زمان یک پلیت ۹۶ خانه لازم است. هر رقت یک ردیف را در پلیت به خود اختصاص می دهد (حدوداً ۴ تا ۶ چاهک). میانگین عدد ۳ چاهک ،نمایانگر تاثیر دارو روی سلول در آن دوز خاص است. در هنگام کاشت سلول برای همگن کاشتن به ازای هر ۴ تا ۸ چاهک پر، یکبار سوسپانسیون را هم زده تا سلول ها به صورت یکسان در سوسپانسیون پراکنده شوند. توجه شود در هنگام پر کردن هر ۳ پلیت ۲۴ ، ۴۸ ، ۷۲ را باهم باید کاشت به این معنا که ابتدای ستون های ۱ هر پیلت، بعد ۲ و همین طور تا آخر پر می شود. باید توجه داشت که نحوه ی پخش شدن سلول ها در چاهک ها و تراکم یکسان آنها تاثیر بسیار مهمی در نتیجه گیری خواهد داشت.
حال به سلول ها ۲۴ ساعت فرصت داده می شود تا به کف چاهک بچسبند.
در روز دوم پلیت ها را از انکوباتور خارج شده و تراکم شان زیر میکروسکوپ مشاهده می شود. در صورتیکه به صورت یکسان پخش شده باشند می توان تیمار با رقت های مختلفی از دارو را تهیه کرد. ردیف نخست هر پلیت ردیف شاهد است و نباید با دارو تیمار شود. از این ردیف برای کنترل نتیجه استفاده می شود. ردیفِ اول تنها با محیط کشت پر می شود اما از ردیف ۲ تا آخر به ترتیب هر ردیف نمایانگر یک رقت بوده و با آن رقت خاص پر می شود این کار برای هر ۳ پلیت انجام می شود. دوباره پلیت ها به انکوباتور منتقل شده و یک فرصت ۲۴ ساعته برای تاثیر دارو به پلیت ها داده می شود. در روز سوم پلیت مخصوص ۲۴ ساعت از انکوباتور خارج شده، حال مواد داخل هر چاهک با محلول MTT جایگزین می شود. دوباره پلیت به انکوباتور منتقل شده و به آن ۳ ساعت زمان برای اثرگذاری MTT داده می شود. پس از ۳ ساعت پلیت از انکوباتور خارج شده و MTTدرون چاهک با محلول DMSO 100μL جایگزین می شود. هرچاهک شروع به تغییر رنگ می کند. مشاهدات نشان داده هرچه تعداد بیشتری سلول مرده باشند رنگ چاهک ها سفید رنگ تر می شود. حال پلیت را در دستگاه Elisa Reader گذاشته و در طول موج ۵۷۰ با طول موج مبنای ۶۳۰ خوانده می شود. از این طریق می توان توان حیاتی سلول که همان میزان سیتوتوکسیسیتی سلول است را به دست آورد. در کنار این اتفاقات برای پلیت ۲۴ ساعت در روز سوم پلیت های ۴۸ و ۷۲ ساعت مانند روز قبل با رقت های مختلف پر شده و دوباره در انکوباتور گذاشته می شوند. در روز چهارم پلیت ۴۸ ساعت مشابه پلیت ۲۴ ساعت روز گذشته از MTTپر شده. بعد از ۳ ساعت با DMSO پر شده و طول موج آن خوانده می شود.
پلیت ۷۲ ساعت دوباره با رقت های مختلف تیمار شده و در انکوباتور گذاشته می شود.
در روز پنجم پلیت ۷۲ ساعت با MTTپر شده و بعد از سه ساعت به آن DMSOزده می شود و طول موجش با Elisa Reader خوانده می شود.
لازم به تذکر است برای هر رده ی سلولی ۳ بار تکرار MTTگذاشته می شود تا احتمال وقوع خطا کاهش یابد.
باید دقت شود که اکثر دارو های استفاده شده در مدت زمان ۲۴ ساعت روی سلول ها اثر میکنند اما بسیاری از مقالات تا ۷۲ ساعت تاثیر گذاری دارو را تست میکنند
از طرف دیگر در بعضی ازمایش ها اضافه کردن هر روزه ی دارو انجام نمیشود این بستگی به نوع دارو و مرور مقالات دارد.

تحلیل داده های Elisa Reader و تعیین توان حیاتی
پلیت ها پس از اضافه شدن DMSOشروع به تغییر رنگ می کنند. شاهد ها که بدون دارو هستند تماماً ارغوانی رنگ می شود این مسئله گویای بارز زنده بودن کامل سلول ها است. اما هرچه رقت دارو بیشتر می شود بر میزان مرگ سلول اضافه شده و رنگ چاهک سفید می شود. این مسئله در مورد پلیت های ۲۴،۴۸،۷۲ نیز صادق است. رنگ چاهک ها در پلیت ۲۴ نسبت به پلیت های ۴۸ و ۷۲ بنفش تر است زیرا دارو زمان لازم برای کشتن کامل سلول ها را نداشته، اما پلیت ۷۲ تقریباً سفید است زیرا دارو زمان لازم برای کشتن سلول ها را داشته است. معمولاً بهترین زمان برای تعیین IC50 (دوزی که در آن ۵۰ درصد سلول یا بیشتر زنده هستند) پلیت ۴۸ ساعت است. در دستگاه Elisa Reader هرچه چاهک ارغوانی تر باشد طول موج بیشتری را نشان می دهد پس شاهد بالاترین طول موج را دارد و هر چه رقت دارو بیشتر شود طول موج کاهش می یابد.

میزان سیتوتوکسیسیتی سلول ها براساس میزان جذب آنها محاسبه می شود. به این ترتیب که از هر ۶ طول موج خوانده شده ی ۶ چاهک مربوط به هر دوز، سه طول موج که بیشتر به هم نزدیک است انتخاب شده و میانگین آن گرفته می شود. میانگین جذب نمونه ی تیمار هر دوز بر میانگین سه طول موج کنترل تقسیم شده و عدد آن در ۱۰۰ ضرب می شود.
حیاتی توان درصد= (شده تیمار نمونه جذب)/(کنترل نمونه جذب) ×۱۰۰

عددها را برای هر دوز نوشته حال دوزهایی که توان حیاتی ۵۰ به بالا دارند IC5O مناسبی برای سلول مورد نظر هستند. برای ادامه پژوهش به دوزهایی نیاز است که از IC50 بالاتر باشند. یعنی بیشتر از ۵۰ درصد سلول ها در دوز مورد نظر زنده مانده باشند.

دوستان برای اطلاعات بیتر در مورد نحوه ی انجام تست MTT لطفا به قسمت وبلاگ مبحث تست MTT برای بررسی میزان سمی زایی دارو ها بر روی سلول مراجعه فرمایید

print
Tags: , ,


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

پنج + هجده =