جدا سازی و کشت سلول های فیبروبلاست جنینی موش

برای کشت سلول های بنیادی جنینی انسانی، سلول های فیبروبلاست جنینی موش لازم است. این سلول ها فاکتورهای مورد نیاز برای رشد و حفظ حالت پرتوانی سلول های بنیادی جنینی را تولید و ترشح می کنند، به همین خاطر از سلول های فیبروبلاستی جنینی موش به عنوان لایه تغذیه کننده سلول های بنیادی جنینی استفاده می شود. برای جلوگیری از ادامه تقسیم سلول های فیبروبلاست جنینی موش، پیش از کشت سلول های بنیادی جنینی روی آنها، از مایتومایسینC استفاده می شود.

برای تهیه Mouse Embryonic Fibroblast، از موش های حامله با جنین های ۵/۱۳-۱۳ روزه استفاده می شود. فیبروبلاست های جنینی موش به ترتیب زیر جداسازی گردیده اند.
۱) جنین ها از درون لوله رحمی خارج شده و چندین بار با PBS فاقد کلسیم و منیزیم و دارای آنتی بیوتیک های پنی سیلین و استرپتومایسین شستشو داده می شوند. برای حفظ سترونی سلول ها مابقی مراحل زیر هود بیولوژیک کلاس  و در شرایط سترون انجاممی شود.
۲) ابتدا، لایه های کوریون و آمنیون از جنین جدا شده سپس، سر و ناحیه شکمی و دم و دست و پا و طناب عصبی را جدامی گردد.
۳) مابقی تنه جنین با تیغ جراحی خرد شده و بافت خرد شده همراه با تریپسین-EDTA به درون یک بشر کوچک استریل دارای مگنت منتقل گردیده و به مدت۲۰-۱۰ دقیقه در انکوباتور c37 با ۵ درصد CO2 و ۹۵ درصد رطوبت روی همزن کوچک مغناطیسی قرار میگیرد.
۴) سلول های منفرد از بافت های بزرگتر هضم نشده جدا شده و پس از انتقال به یک فالکون ۱۵ میلی لیتری ، به آنها محیط تازه DMEM حاوی ۱۰ درصد FBS و ۱ درصد آنتی بیوتیک های پنی سیلین و استرپتومایسین و ۱ درصد L-گلوتامین اضافه می شود. سلول ها به مدت ۵ دقیقه با دور rpm1500 سانتریفیوژ میشوند.
۵) سپس، محیط رویی دور ریخته شده و ته نشست تشکیل شده در محیط کشت تازه حاوی ۱۰ درصد FBS معلق و برای کشت، به فلاسک های کشت سلولی T25 ( Nunclon) منتقل میشود و در داخل انکوباتورc37 قرار میگیرد. سلول های به دست آمده در این مرحله، پاساژ صفر محسوب می شوند.
۶) سلول های MEF پس از رسیدن به تراکم به ۹۰-۸۰ درصد پاساژ داده میشوند.
سلول های فیبروبلاست جنینی موش در مرحله پاساژ ۴-۲ به عنوان لایه تغذیه کننده برای کشت سلول های بنیادی جنینی مورد استفاده قرار می گیرند. در این مرحله، جهت چسبندگی بهتر سلول ها از ظروف کشتی استفاده می شود که با ژلاتین ۱/۰ درصد پوشیده شده اند. قابل ذکر است که برای تهیه ژلاتین ۱/۰ درصد، ۱۰۰ میلی گرم پودر ژلاتین را با ۱۰۰ میلی لیتر آب دیونیزه مخلوط کرده و به مدت ۴۵ دقیقه اتوکلاو می کنیم. محلول ژلاتین در یخچال و دمای c4 نگهداری می شود.
متوقف کردن تقسیم سلول های MEF
۲ میلی گرم پودر میتومایسین C را با ۱۰ میلی لیتر PBS فاقد کلسیم و منیزیوم مخلوط می کنیم تا محلول ذخیره با غلظت ۲/۰ میلی گرم در میلی لیتر حاصل شود. محلول حاصله در دمای c20- نگهداری می گردد.

بعد از اینکه سلول ها به پاساژ ۴-۲ و به تراکم ۹۰-۸۰ درصد میرسند، به آنها مایتومایسینC اضافه شده تا تقسیم آنها متوقف شود. برای این کار، به ترتیب، مراحل زیر انجام می شود:
۱) سلول ها به مدت ۳-۲ ساعت در معرض میتومایسین C با غلظت نهایی ۰۱/۰ میلی گرم در میلی لیتر قرار می گیرند. برای این منظور، ۳۰۰ میکرولیتر از محلول ذخیره میتومایسین تهیه شده به ۶ میلی لیتر محیط کشت افزوده میشود.
۲) محیط رویی سلول ها خالی و لایه سلولی داخل فلاسک کشت سلول، ۳-۲ بار با PBS- شستشو داده میشود. سپس، محیط کشت تازه DMEM حاوی ۱۰ درصد FBS ، ۱ درصد آنتی بیوتیک های پنی سیلین و استرپتومایسین و ۱ درصد L-گلوتامین به سلول ها اضافه شده و سلول ها داخل انکوباتور قرار داده می شوند. ۲۴ ساعت بعد از تیمار با مایتومایسین C می توان از این سلول های فیبروبلاستی جنینی موش به عنوان لایه تغذیه کننده برای سلول های بنیادی جنینی انسانی استفاده کرد.

کشت سلول های بنیادی جنینی انسانی (ES)
رده سلول های بنیادی جنینی انسانی Royan H1 از بانک سلولی موسسه رویان خریداری می شود. این سلول های به صورت تمایز نیافته روی سلول های فیبروبلاست جنینی موش که تقسیم آنها با مایتومایسین C متوقف شده کشت داده می شوند. محیط کشت مورد استفاده در این مرحله DMEM/F12 میباشد که با مواد زیر تکمیل گردید:
۱) ۲۰ درصد سرم ) KOSR (Knock Out Serum Replacement
۲) ۱ درصد اسیدهای آمینه غیر ضروری
۳) ۱ درصد آنتی بیوتیک های پنی سیلین و استرپتومایسین
۴) ۱ درصد L – گلوتامین
۵) ۱/۰ میلی مولار -مرکاپتواتانول
۶) ۴ میکروگرم بر میلی لیتر فاکتور رشد فیبروبلاستی بازی ( bFGF)

جداسازی سلول های بنیادی جنینی انسانی از سلول های فیبروبلاست جنینی موش
کلونی های سلول های بنیادی جنینی انسانی که در فلاسک های T25 ژلاتینه روی فیبروبلاست های جنینی موش (MEF) رشد کرده بودند، از سلول های لایه تغذیه کننده جدا میشوند. برای این منظور، به ترتیب زیر عمل میشود :
۱) فلاسک های حاوی سلول های بنیادی جنینی از انکوباتور خارج شده و محیط رویی سلول ها خالی شد و سلول ها دو بار با بافر PBS – شستشو داده میشوند.
۲) سپس، به سلول ها یک میلی لیتر آنزیم جداسازی (کلاژناز IV با غلظت ۱ میلی گرم بر لیتر) اضافه شده و فلاسک به مدت ۱۰-۵ دقیقه داخل انکوباتور با دمای c37 قرار گرفته تا کلونی های سلول های بنیادی جنینی جدا شوند.
۳) کلونی های جدا شده به یک لوله سانتریفوژ ۱۵ میلی لیتری منتقل می شود. برای اطمینان از حذف سلول های فیبروبلاست جنینی موش، حدود ۲۵۰ میکرولیتر تریپسین- EDTA گرم به کلونی ها افزوده شده تا در طی حدود ۳۰ ثانیه سلول های منفرد حاصل گردد. سپس، ۳-۲ میلی لیتر از محیط کشت مخصوص سلول های بنیادی جنینی به سوسپانسیون سلولی اضافه شده و سلول ها به مدت ۵ دقیقه و با دور rpm1000–۸۰۰ سانتریفیوژ می گردد. سپس، محیط رویی خالی و به ته نشست سلولی، محیط کشت مخصوص سلول های بنیادی جنینی اضافه میشود.
۴) سوسپانسیون سلولی به فلاسک های T25 ژلاتینه منتقل شده و به مدت ۴۵ دقیقه تا یک ساعت داخل انکوباتور c37 قرار گرفته تا سلول های فیبروبلاستی که همراه سلول های بنیادی جنینی هستند به کف فلاسک بچسبند. این مرحله یکبار دیگر تکرار شد.
۵) سلول های بنیادی جنینی که شناور مانده بودند به یک لوله سانتریفوژ ۱۵ میلی لیتری منتقل و سانتریفیوژمیشوند.

print
Tags: , ,


۱ دیدگاه

  • Rezvan says:

    با عرض سلام و خسته نباشید خدمت شما و تشکر برای تهیه این پروتکل خیلی واضح و روانتون. عالی بود. بنده با سلول چسبنده کار نمیکنم ولی همکارانم هستند و اینقدر واضح متوجه کار با این سلول ها نبودم. خیلی ممنون بابت سایت مفید و ارزندتون.موفق و پایدار باشید.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

یک + 1 =