Molecular Cloning

سلام به همه ی شما همراهان نت سای…
امروز میخوایم در مورد مبحث بسیار بسیار جذاب DNA Cloning صحبت کنیم.

در ابتدا بیاین یک تعریف کلی از کلونینگ داشته باشیم:
کلونینگ به معنای وارد کردن یک قطعه ژنی جدید در داخل یک وکتوره. چرا؟؟؟ چون ما نیاز داریم که قطعه ی ژنی خودمون که ژن مورد نظر ما رو داره ( در کلونینگ بهش میگیم insert) وارد وکتوری بکنیم که ویژگی های مورد نظرمون مثل مقاوم بودن به یک انتی بیوتیک خاص، دارا بودن مارکر خاصی مثل GFP و یا Jred و یا حتی پروموتر قوی داشتن رو داره( بهش میگیم وکتور)، بکنیم.
بهتره بدونین که عموما قطعات DNA ای که میخوایم وارد وکتور کنیم و وکتور مورد نظرمون درون پلاسمید ها هستن.

پس هدف ما باید در ابتدا استخراج پلاسمید هایی که دارای قطعه ی ژنی ما و وکتور مورد نظرمون هستن از باکتری باشه. برای اینکار به پروتکل استخراج پلاسمید از باکتری مراجعه کنین.
وقتی پلاسمید هامون رو با کیفیت عالی استخراج کردیم تازه مراحل Cloning اغاز میشه…
بعد از استخراج پلاسمید های insert و وکتور حالا ما دو تا ویال داریم که پلاسمید هامون توشه..یادتون باشه که حتما ویال ها رو lable بزنین تا قاطی نشن.
مراحل cloning رو کلی نام میبرم و بعد با هم هر مرحله رو کامل بررسی میکنیم..
کلونینگ از ۳ مرحله ی کلی تشکیل شده:
۱- مرحله ی cut
۲- مرحله ی Purification
۳- مرحله ی Ligation

Molecular cloningمرحله ی اول مرحله cut هست:
در این مرحله ما باید هر دو تا پلاسمید insert و وکتورمون رو با انزیم های محدود کننده ی مشترک که انتها های یکسانی رو میبرن برش بزنیم.
دقت کنین که انزیم محدود کننده برای هر دو پلاسمید یکسان باشه و یا انتها های چسبنده ی یکسان ایجاد کنه.
برای پیدا کردن اینکه از چه انزیم محدود کننده ای باید استفاده کنین باید به نقشه ی ژنی پلاسمید های insert و وکتور مراجعه کنین. نقشه ی ژنی بهتون میگه که انتها های قطعات مورد نظر تون چه توالی هایی دارند و جایگاه برش کدام انزیم های محدود کننده هستن.
به محل برش ها روی نقشه دقت کنین چون باید طول قطعات رو بعد از برش بدونین تا بتونین روی ژل قطعه ی مورد نظرتون رو بعد از برش پیدا کنین.( پس به نقشه ی ژنی پلاسمید هاتون خیلی دقت کنین و کاملا بهشون مسلط باشن)

شمایی از یک وکتور که قطعه ی ژنی مورد نظر ما باید وارد ناحیه ی MCS بشه

شمایی از یک وکتور که قطعه ی ژنی مورد نظر ما باید وارد ناحیه ی MCS بشه

انزیم محدود کننده عموما در پلاسمید وکتور یک شکاف ایجاد میکنند پس در انتهای عمل برش نباید طول پلاسمید ما تغییر کرده باشه.
اما انزیم محدود کننده در پلاسمیدی که میخوایم قطعه ی ژنی مورد نظرمون رو ازش جدا کنیم دو شکاف در دو انتهای ژن مورد نظرمون ایجاد میکنه پس باید بعد از عمل برش دو قطعه روی ژل ببینین که یکی از انها قطعه ی مورد نظر ماست پس حتما روی نقشه سایز قطعه ی ژنی تون بعد از برش با انزیم محدود کننده رو پیدا کنین.

شکلی از پلاسمید دارای قطعه ی ژنی GFP. در اینجا بعد از برش قطعه ی مربوط به ژن GFP با انزیم های محدود کننده ی BamH1 و Eag1 انتظار داریم که طول قطعه ی ژنی مورد نظرمون ۲۰۱=۹۷۵-۱۷۱۶ باشد.

⁉خوب تا اینجا رو متوجه شدین؟؟؟
پس میریم سراغ پروتکل و مراحل انجام مرحله ی cut:

برای انجام کار ما نیاز به مواد زیر داریم:
۱-دو تا ویال که که یکی مخصوص برش گیری از وکتور و دیگری مخصوص برش گیری از insert هستن.
۲- پلاسمید خالص وکتور و insert ( مقادیری که باید از این دو در هر ویال استفاده کنین بستگی به کیفیت و غلظت پلاسمید استخراج شدتون داره  (برای همینه که میگم مرحله ی استخراج پلاسمید از باکتری خیلیییییی مهمه) اما همیشه باید مقدار پلاسمید وکتورتون در ویال مربوطه اش در حدود نصف مقدار پلاسمید insert در ویال مربوطه اش باشه. یعنی اگر مثلا ۵ul وکتور به ویال وکتور میریزین در حدود ۱۰ul از پلاسمید insert به ویال insert وارد کنین.
اینکه مقدار همیشه نصف باشه درست نیست بازم میگم بسته به غلظت پلاسمید هاتون داره اما همیشه مقدار وکتور از insert در مرحله ی cut کمتره.

۳- انزیم محدود کننده بهمراه بافرش که معمولا مقدار بافر دو برابر مقدار انزیمه ( اما یک نکته ی مهم بهتون میگم اگر انزیمتون قدیمیه مقدار بافر و انزیم رو یکسان بریزین تا از فعالیت های غیر اختصاصیه انزیم در جایگاه های غیر اختصاصی جلوگیری کنین)
۴- اب DEPC
۵- انزیم CIP و بافر مربوطه اش. (دقت کنین که CIP رو فقط به پلاسمید وکتورتون اضافه کنین چون کار این انزیم برداشتن فسفات های انتهای توالی برش خورده است تا انتهاهای برش خورده دوباره بهم نچسبن )

خوب حالا پروتکل انجام کار:
در مرحله اول ابتدا در دو ویال موادی رو که گفتم اضافه کنین( فقط یادتون باشه که روی ویال های وکتور و insert رو lable بزنین تا یه وقت اشتباهی وارد نکنین.)
دقت کنین در مرحله ی اول انزیم CIP رو به ویال وکتور اضافه نکنین این انزیم مال مراحل بعدیه. پس فقط پلاسمید ، انزیم محدود کننده ، بافر مربوطه اش و اب رو اضافه کنین.
چون مقادیر خیلی کمه دقت کنین که مواد رو از کناره ی ویال وارد کنین.

در مرحله ی بعد باید ویال هاتون رو در بن ماری و یا hotplate در دمای ۳۷ درجه بذارین تا انزیم محدود کننده شروع به کار کنه.مدت زمان این مرحله نسبیه و بستگی به کیفیت پلاسمید ها و انزیم شما داره ( فقط حواستون باشه اگر زمان رو زیاد کنین برش های غیر اختصاصی خواهید داشت که اصلا خوب نیست پس شاید این مرحله تون برای set up شدن کمی طول بکشه)
بعد از تموم شدن این مرحله لازمه که انزیمتون رو غیر فعال کنین تا دیگه برش ایجاد نکنه برای این کار ویال ها رو به hotplate با دمای ۶۵ تا ۷۰ درجه منتقل میکنیم. این دما باعث از بین رفتن ساختار سوم انزیم و از دست رفتن فعالیت کاتالیتیکی اون میشه. مدت زمان اینکار عموما ۲۰ دقیقه است

میتونین برای غیر فعال کردن انزیم از اتیلن دی امین (ADT) هم استفاده کنین.
دقت کنین اگر کاملا به دماها و مدت زمان عمل انزیم محدود کننده و غیر فعال کردن اون مسلط هستین میتونین این مراحل رو در PCR انجام بدین یعنی برنامه ی زمانی و دماییتون رو به دستگاه PCR بدین تا خودش براتون انجام بده.

وقتی این مراحل تموم شد دیگه با ویال insert کاری نداریم اما باید به ویال وکتورمون انزیم CIP رو همراه با بافرش اضافه کنیم.
دقت کنین ویال وکتور رو که از ۷۰ درجه برداشتین صبر کنین در دای اتاق خنک بشه بعدش انزیم CIP رو اضافه کنین تا انزیم در اون دما غیر فعال نشه.
مقدار و مدت زمان عمل CIP بسته به کیفیت انزیمتون داره اما حواستون باشه که بعد از اضافه کردن CIP ویال رو به hotplate با دمای ۳۷ درجه منتقل کنین. مدت زمانش میتونه بین ۳۰ تا ۴۵ دقیقه باشه.
بعدش برای غیر فعال کردن انزیم ویال رو به hotplate با دمای ۶۵ تا ۷۰ درجه منتقل کنین .

خوب خسته نباشین اگر این مراحل رو درست رفته باشین الان در ویال هاتون وکتور و insert برش خورده دارین.
حالا باید رفت به مرحله ی بعد
برای تعیین کیفیت کارتون و اینکه قطعات درست برش خورده اند باید اونها رو ببرین روی ژل الکتروفورز با اگارز ۰٫۷%.
روش درست کردن ژل و run کردن پلاسمید ها رو قبلا بهتون گفتم دقیقا شبیه به تعیین کیفی استخراج پلاسمید هاست.
فقط DNA Ladder برای بررسی اندازه ی قطعات یادتون نره.

بعد از run کردن قطعات انتظار داریم که در پلاسمید وکتور که یک شکاف ایجاد شده تغییر اندازه نبینیم و بر اساس اندازه ای که در نقشه ی ژنی وکتور دیدیم ، طول وکتور روی ژل نباید تغییر کرده باشه.
اما پلاسمید insert چون کاملا قطعه ی ما از کل پلاسمید جدا شده پی ما انتظار دیدن دو قطعه روی ژل رو داریم که یکی از قطعات که عموما کوچکتره قطعه ی ژنی مورد نظر ماست که طولش رو از نقشه ی ژنی بدست میاریم ( در شکل توضیح دادم).

نمایی از ژل الکتروفورز بعد از مرحله ی cut

نمایی از ژل الکتروفورز بعد از مرحله ی cut

اگر مراحل رو درست انجام داده باشین روی ژلتون هم پلاسمید وکتور در جایگاه اندازه ی خودش و هم قطعه ی ژنی بریده شده تون در جایگاه اندازه ی خودش رو میبینین. حالا باید قطعات رو از روی ژل ببرین تا خالصش کنین. این مرحله Purification نام داره.

در اینجا منظور از purification ، خالص سازی قطعات DNA وکتور و insert از ژلمون هست.
برای این کار ابتدا وقتی DNA ها رو روی ژل run کردین باید ببرینش توی دستگاه برش که نور UV داره زیر اون دستگاه میتونین جای باند ها رو ببینین. وقتی جای باند های مورد نظرتون رو پیدا کردین نور UV رو خاموش کنین و زیر نور معمولی با یک تیغ کوچک استریل با دقت و به ارامی قطعه ی باند مورد نظرتون رو ببرین.

دو تا ویال اماده کنین و روی هر کدوم اسم وکتور و insert تون رو بنویسین حالا قطعه ی ژل مربوط به وکتور رو داخل ویال وکتور و قطعه ی ژل مربوط به insert رو داحل ویال insert بذارین.
دقت کنین که موقع برش خیلی ژل رو در قسمت باند ها خورد نکنین. از طرفی خیلی هم زیاد ژل بر ندارین چون موقع خالص سازی به مشکل بر میخورین.

شمایی از نحوه ی برش ژل

شمایی از نحوه ی برش ژل

خوب حالا ما دو تا ویال داریم که در هرکدوم قطعه ی ژل حاوی باند مورد نظرمون قرار داره.
از اینجا مرحله ی خالص سازی DNA از ژل شروع میشه…
کیت های متعددی برای انجام این کار وجود داره. من خودم از کیت bioneer استفاده کردم و خیلی هم راضی بودم اما شما میتونین بر اساس بودجه تون از کیتهای شرکت های مختلف مثل کیاژن و یا ترموفیشر و … استفاده کنین…

کیت Purification از شرکت Bioneer

کیت Purification از شرکت Bioneer

خوب حالا بیاین قبل از شروع کار اساس کار این کیت ها و بافر هاشون رو با هم بررسی کنیم:
همه ی کیت های purification دارای سه نوع بافر هستن:
۱- بافر Gel binding buffer: این بافر ها به ژل متصل میشن و سبب جدا شدن راحت قطعه ی ژنی از ژل میشن.( مرحله ی اول تخلیص)
۲- بافر Washing Buffer: این بافر سبب شست و شوی DNA و جدا شدن مواد ژلی مثل نمک ها و … از DNA میشه (مرحله ی دوم تخلیص)
۳- بافر Elusion Buffer: این بافر سبب جدا شدن راحت تر DNA از ستون تخلیص میشه.
در هر کیت یکسری ستون های تخلیص هم وجود داره که سبب جداسازی راحت تره DNA از مواد داخل ژل میشه.

خوب حالا که با کیت ها و بافر ها اشنا شدیم کارمون رو شروع میکنیم.
خوب قبل از شروع کار باید قطعه ی ژلی که جدا کردین رو وزن کنین چون مقداربافر gel binding ای که اضافه میکنین بستگی به وزن ژلتون داره>
فقط چند تا نکته در این مرحله هست که باید دقت کنین:
۱- وزن قطعه ی ژلی که جدا کردین نباید بیشتر از ۴۰۰mg باشه. اگر بود اون رو به دو تا ویال منتقل کنین.
۲- برای قطعات DNA ی بالاتر از ۳kb از مقدار سه برابر وزن ژل بافر gel binding اضافه کنین. مثلا اگر وزن ژلتون ۴۰۰mg هست باید ۴۰۰*۳ یعنی ۱۲۰۰ul بافر gel binding اضافه کنین.

۳- برای قطعات پایین تر ۳kb مقدار ۵ برابر وزن ژل بافر gel binding اضافه کنین.متوجه شدین؟؟؟ این مرحله خیلی مهمه پس حسابی دقت کنین.
البته نگران نباشین در هر کیتی که بخرین دستورالعمل کار نوشته شده از اونجا هم میتونین بخونین. مقادیر بسته به نوع کیتی که خریداری میکنین متفاوته من مقادیر کیت Bioneer رو براتون گفتم.

خوب وقتی که به هرکدوم از ویال هاتون مقدار مناسبی بافر Gel Binding اضافه کردین حالا به مدت ۱۰ دقیقه شدیدا ورتکس کنین.در حین ورتکس گاهی هم ویال رو به hotplate 60 درجه منتقل کنین. این کار روی انقدر ادامه بدین تا کاملا ژلتون در ویال حل بشه.
بازم تاکید میکنم پیپتاژ در این مرحله خیلیییییی مهمه درست مثل مرحله ی پیپتاژ استخراج پلاسمید.
در این مرحله ممکنه دچار یه مشکل بشین و اونهم تغییر ph هست که ممکنه ویالتون رو زرد کنه. اگر دچار این مشکل شدین به ویالتون سدیم استات ۳mM اضافه کنین ( فقط دقت کنین فرمول سدیم استاتتون بدون اب باشه). سدیم استات سبب پایدار ماندن PH محیطتون میشه.

 بعد از مرحله ی اضافه کردن بافر Gel binding اگر قطعه ی DNA تون از ۳kb بیشتر بود بهش معادل معادل وزن ژلتون ایزوپروپانول سرد اضافه کنین.این کار باعث میشه قطعات DNA بهتری رو تخلیص کنین.
اما حواستون باشه اضافه کردن ایزوپروپانول سرد به قطعاتی با طول زیر ۳KB فایده ای نداره.
بعد از اضافه کردن ایزوپروپانول به ارامی پیپتاژ میکنین و بعدش کل محتویات ویال رو به ستون هایی که داخل کیت هست منتقل میکنین.

حالا ستون ها رو به سانتریفیوژ یخچالدار با دمای ۴ درجه ، دور ۱۳۰۰۰rpm به مدت ۲ دقیقه قرار بدین.
بعد از تموم شدن مدت سانتریفوژ حالا بافر دوم که Washing buffer هست رو به مقدار ۵۰۰ul به هر ستون اضافه میکنین و ۵ دقیقه در دمای اتاق نگه دارین.
دوباره ستون رو به سانتریفوژ یخچالدار در دمای ۴درجه اینبار با دور ۸۰۰۰rpm به مدت ۲ دقیقه منتقل میکنین.
حالا باید بهتون بگم که متاسفانه برای بالا بردن کیفیت کارتون باید دوباره بافر دوم رو بریزین و سانتریفیوژ کنین.

بعد از اتمام سانتریفیوژ اب ستون ها رو دور بریزین و دوباره سانتریفیوژ کنین. اینکار برای اطمینان از این هست که دیگه تمام محتویات ژل کاملا از ستون خارج بشه…
حالا ویال زیر ستون رو با یک ویال کاملا استریل تعویض کنین و بعد مقدار ۲۰-۳۰ul از بافر Elusion رو به ارامی از وسط ستون به ویال اضافه کنین.
۵دقیقه در دمای اتاق نگهدارین و بعدش به مدت ۳ دقیقه در دور ۱۳۰۰۰rpm سانترفیوژ کنین. مایعی که از ستون خارج میشه DNA مورد نظر شماست…
یک نکته ی خیلی مهم در این مرحله اینه که یادتون نره بافر Elusion حتما باید موقع مصرف گرم باشه پس قبل از استفاده در بن ماری گرمش کنین.( درست مثل استخراج پلاسمید از باکتری)

خوب دیگه کارتون تموم شد حالا میرسین به مرحله ی پر استرس کار که اونم بررسی کیفی و کمی DNA تخلیص شدتونه…
پس یکبار مقداری از DNA تون رو روی ژل اگاروز ۰٫۷% run کنین و کیفیتش رو بسنجین.
یکبار هم با دستگاه نانودراپ غلظت و خلوصش رو بررسی کنین. فقط یادتون باشه که مقادیر غلظت رو یادداشت کنین چون برای مرحله ی بعد که ligation هست باید وکتور و insert رو بر اساس غلظتشون با هم ترکیب کنین.

یک نکته که اکثر بچه ها رعایت نمیکنن و باعث میشه غلظت DNA شون کم بشه اضافه کردن زیاد بافر ELUSION هست. اگر این بافر رو زیاد بریزین رقت DNA تون خیلی زیاد میشه و کارتون خراب میشه.پس مواظب باشین و کیفیت رو فدای کمیت نکنین.

خوب حالا میرسیم به اخرین مرحله ی کلونینگ که ligation نام داره.

ما توی این مدت پلاسمید های وکتور و Insert مون رو با انزیم محدود کننده بریدیم، بهدش اون ها رو از روی ژل تخلیص کردیم و الان میخوایم با کمک انزیم لیگازT4 اونها رو به هم وصل کنیم….
مواد لازم برای این مرحله رو فکر کنم همه تون بدونین اما من باز هم میگم:
۱- وکتور
۲- قطعه ای که میخوایک به وکتور وارد کنیم( insert)
۳- انزیم لیگاز T4
۴- بافر انزیم
۵- اب

حالا من ازتون یه سوالی دارم… از کجا بدونیم که چقدر باید از وکتور و insert مون برداریم؟؟؟ نسبت بین اندازه های وکتور و insert رو از کجا بدست بیاریم؟؟؟
با توجه به اهمیت این روش استفاده از مقادیر درست وکتور و Insert خیلی خیلییییی مهمه پس اگر جواب سوال بالا رو نمیدونین با دقت مطلب بعدی رو بخونین…

ببینین راه های مختلفی برای بدست اوردن نسبت بین وکتور و insert هست که بعضی هاش به صورت چشمی و بعضی هاش با فرموله…
خیلی از اساتیدتون ممکنه بر اساس تجربه ای که در کار cloning دارن با توجه به باند های وکتور و Insert روی ژل بعد از مرحله ی خالص سازی بهتون یک نسبت بین ۱:۱ تا ۱:۵ بدن.
اما اگه از من میشنوین هرگز به راه های چشمی اعتماد نکنین چون جواب نمیده.. پس باید چیکار کنیم؟؟؟ الان بهتون میگم..
یک فرمولی وجود داره که با کمک اون به راحتی میتونین این نسبت رو بدست بیارین:
insert/vector= insert(ng)* size vector(kb)/vector(ng)* size insert(kb
متوجه شدین چی شد؟؟؟!!!

ببینین شما بعد از تخلیص DNA های وکتور و insert باید اونا رو ببرین نانودراپ و غلظت ۱ul ازDNA هاتون رو به ng از دستگاه بگیرین.
حالا که مقدار ng از DNA در هر ۱ul از نمونه تون رو دارین باید بر اساس نقشه ی ژنی پلاسمید هاتون اندازه ی قطعات رو هم بدست بیارین. حالا وقتی اعداد رو در فرمول بالا وارد کنین نسبت مقدار insert به وکتورتون بدست میاد…. بهمین راحتی..
قدر فرمول بالا رو بدونین چون حتی خیلی از اساتید هم اینو نمیدونن.

خوب حالا بر اساس نسبت هایی که بدست اوردین می فهمین که چقدر باید از ویال اصلیتون وکتور و insert بردارین. مثلا اگر نسبت insert به وکتورتون ۲:۱ بدست اومد حالا متوجه شدین که به ازای ۱ng از وکتورتون باید ۲ng از insert تون بردارین حالا با یک نسبت گیری ساده معادل ng به ul رو حساب کنین تا متوجه بشین چقدر باید از ویال های اصلیتون بردارین…
متوجه شدین؟؟؟ سوالی نیست؟؟؟ پس بریم مرحله ی بعد…

در مرحله ی بعد باید مقادیری از وکتور و insert رو که محاسبه کردیم با انزیم لیگاز و بافر و اب مخلوط کنیم و بذاریم یک مدت بمونه تا عمل لیگاسیون انجام بشه…
چقدر باید از انزیم و بافر بردارین؟؟؟ چه مدت باید مهلت بدین تا انزیم عمل کنه؟؟؟ جوابش اینه که بستگی به کیت انزیمی شرکتی داره که انزیم رو ازش خریدین… اگر تازه انزیم رو خریدین حتما توی دستورالعملش نوشته که چه مقدار و چه مدت برای کار انزیم لازمه.. اما اگر استادتون خسیسه و انزیمتون قدیمیه باید انقدر ازمون و خطا انجام بدین تا مقدار صحیح انزیم و مدت زمان لازم برای لیگاسیون دستتون بیاد( پس یادتون باشه که با استاد خسیس باید صبور بود)
فقط یک مسئله ی مهم که نباید یادتون بره غیر فعال کردن عمل انزین بعد از اتمام کاره.. که عموما برای اینکار باید به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۶۵ درجه انزیم را غیر فعال کنین…

خوب تصور کنین که تمام این مراحل رو رفتین و تموم شد.. حالا من یک سوالی ازتون دارم… از کجا بفهمیم که كارمون رو درست انجام دادیم؟؟؟ از کجا بفهمیم که insert وارد جایگاه درستی در وکتور شده؟؟؟ از کجا بفهمیم که به صورت sense داخل شده نه antisense و حتما در باکتریمون بیان خواهد داشت؟؟؟
ببینین این مرحله یکمی سخت و زمانبره و دقت خیلیییی بالایی میخواد.
اولش که باید یکمی از محصول لیگاسیونتون رو ببرین روی ژل ۰٫۷% تا مطمئن بشین قطعه تون ساخته شده ( یعنی باید باندی به اندازه ی طول وکتور و insert تون با هم ببینین.
بعدش برای اینکه مطمئن بشین insert درست درون وکتور وارد شده باید یک سری بزنین به نقشه ی ژنی پلاسمید های وکتور و insert تون. حالا سعی کنین روی قطعه ی insert و وکتورتون جایگاه های برشی برای انزیم های محدود کننده پیدا کنین به طوری که اين جايگاه هاي برش بتونه قسمتي از وكتور و insert رو برش بزنه و از طرفي اگر با اونها محصول لیگاسیونتون رو cut کنین قطعاتی با طول های مشخص بهتون بده که بتونین روی ژل دنبالش بگردین…

برای این مرحله زمان زیادی بذارین. سعی کنین از جایگاه هایی استفاده کنین که اندازه ی قطعه ای که بعد از برش بهتون میده خیلی کوچک نباشه که روی ژل نتونین ببینینش. خیلی هم جایگاه ها بهم نزدیک نباشه که قطعهات رو قاطی کنین…
حالا باز هم باید مشابه مرحله cut که براتون توضیح دارم محصول لیگاسیونتون رو با مقدار مسخصی از انزیم های محدودکننده و بافرشون ترکیب کنین و طبق پروتکل انزیم ها بهشون زمان بدین تا عمل کنن.
بعدش که مرحله ی Cut تموم شد حالا باید محصولات رو روی ژل اگارز۰٫۷% ببرین و باند ها رو بررسی کنین. اگر باند ها دقیقا درجایگاه اندازه ای بودند که طبق نقشه ی ژنی بعد از Cut انتظار داشتین یعنی شما کارتون رو درست انجام دادین اما اگر باند ها در جایگاه های اشتباه بودن یعنی باید دوباره مرحله ی لیگاسیون رو تکرار کینین..
یادتون باشه در cloning صبر داشتن حرف اول رو میزنه پس صبور باشین ممکنه دفعات عمل برای یک cloning ساده مجبور بشین چندین ماه وقت بذارین اما مطمئن باشین وقتی تجربه کسب کنین دیگه براتون خیلی راحت میشه( دیدم که میگم)

خوب حالا تصور کنین که ما روی ژلمون دقیقا باند ها رو در جایگاهی که انتظار داشتیم دیدیم و مطمئن شدیم که لیگاسیونمون درست انجام شده مرحله ی بعد چیه؟؟؟
مرحله ی بعد وارد کردن محصولمون به اخل باکتریه تا مطمئن بشیم که در درون باکتری بیان میشه…
اگر گفتین اسم اینکار چی بود؟؟؟؟؟ ترانسفورماسیون… میدونم که همه ی همراهان نت سای الان کاملا به این تکنیک وارد هستن چون با تفصیل در کانال راجع بهش صحبت کردیم اما چنانچه بعضی ها تازه به جمع ما پیوستن باید بهتون بگم که پروتکل کامل ترانسفورماسیون هم در کانال و هم در سایت netsaai در قسمت پروتکل ها و وبلاگ موجوده پس حتما حتما برین و مطالعه اش کنین. کلیپش رو هم میتونین در هر دو جا ببینین..

خوب حالا ما تراسفورماسیون رو انجام دادیم و محصول cloning مون رو وارد باکتری کردیم از کجا متوجه بشیم که محصول کلونینگ ما در باکتری بیان داره و درست کار میکنه؟؟؟
ببینین الان باید یک توضیحی در مورد selection marker ها در غربالگری بهتون بدم.
همونطور که هممون میدونیم برروی پلاسمید ها عموما یم مارکر تشخیصی از نوع قطعات ژنی مقاوم به انتی بیوتیک وجود داره که وقتی ترانسفورماسیون رو انجام میدیم بهمون کمک میکنه تا باکتری ترانسفرم شده ی ما در محیط LB جامد حاوی انتی بیوتیک کورد نظر رشد کنه.
در اینجا هم همینطوره.. ما بایذ هم بر روی وکتورمون و هم بر روی insert مون یک قطعه ی ژنی مقاوم به نوعی انتی بیوتیک داشته باشیم تا به کمک ان بتونیم باکتری حامل محصول cloning مون در روی پلیت پیدا کنیم. چطوری؟؟؟ الان بهتون میگم..

شما باید برای غربالگری سه تا پلیت LB جامد داشته باشین که :
۱- در یک پلیت باید انتی بیوتیکی رو بریزین که وکتورتون نسبت بهش مقاومه.
۲- در یک پلیت باید انتی بیوتیکی بریزین که insert تون نسبت بهش مقاومه.
۳- و در نهایت در اخرین پلیت باید هر دو تا انتی بیوتیک رو اضافه کنین.

حالا باکتری ها رو روی هر سه تا پلیت کشت بدین و بذارین توی انکوباتور شیکردار . فرداش بیاین و پلیت ها رو ببینین…باکتری هایی که در پلیت اول رشد کردن یعنی فقط وکتور واردشون شده… باکتری هایی که در پلیت دوم رشد کردن فقط insert داخلشون شده و در نهایت باکتری هایی که در پلیت سوم رشد کردن محصول کلیونینگ شما داخلشونه و insert درست داخل وکتور شده که هم ژن مقاومت به انتی بیوتیک در وکتور بیان داشته و هم ژن مقاومت به انتی بیوتیک در insert… پس اگر در پلیت سومتون کلونی دیدین باید به خودتون افتخار کنین که کلونینگ رو درست انجام دادین و بعدش باید از باکتری های روی پلیت سومتون گلیسرول stock تهیه کنین تا بتونین به مدت طولانی نگهش دارین.

حالا ممکنه به من بگین اگر روی قطعه ی insert مون selection marker نداشته باشیم باید چیکار کنیم؟؟؟؟
در اونصورت باکتری هایی رو که در پلیت حاوی انتی بیوتیکی که وکتورتون بهش مقاومه رشد کردن رو باید بردارین و براشون Cracking Test بذارین… با این تست متوجه میشین که در کدوم باکتریتون دقیقا محصول کلونینگتون وجود داره… پس باید چند تا کلونی از جاهای مختلف پلیت بردارین و برای هرکدومشون این تست رو بذارین..
حتما الان این تست رو کاملا بلدین اما اگر بلد نیستین پروتکل انجامش در کانال و سایت هست.

خوب خسته نباشین مبحث cloning هم به طور کاملللللل تموم شد. فکر نمیکنم نکته ای مونده باشه که از قلم انداخته باشم اما باز هم اگر سوالی داشتین ازم بپرسین…

بازم میگم کلونینگ تکنیک بسیار وقت گیر و حساسیه و نیاز به زمان ، دقت و تجربه ی بالا داره اما سعی ما در نت سای اینه که تمام مواردی که ممکنه در کارتون خطا ایجاد کنه و وقتتون رو بگیره پوشش بدیم.. نکاتی که ما در اینجا میگیم نتیجه ی سالها کار در ازمایشگاهه پس مطمئن باشین اگر تمام نکاتی که ما میگیم رو لحاظ کنین خیلیییی در کارتون جلو میافتین و سریعتر نتیجه میگیرین
اطمینان داشته باشین که با ما در نت سای از وقتی که در دنیای مجازی علمی میگذارین نهایت استفاده رو میبرین پس همواره با ما همراه باشین…

print


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

2 × سه =