بررسی کیفی و کمی RNA استخراج شده

سلام به همه ی همراهان دانشجو و محقق هدفمند…
طبق قرارمون امروز باید با هم یاد بگیریم چطوری کیفیت RNA استخراج شده مون رو بررسی کنیم…
پس با ما همراه باشین….

بنظر من ترسناک ترین مرحله ی استخراج RNA مرحله ی ارزیابی کیفیت اونه چون اگر RNA مون کیفیت خوبی نداشته باشه پس cDNA خوبی هم ازش ساخته نمیشه و در نتیجه تمام کارهایی که کردیم به باد فنا میره اما نگران نباشین اگر طبق پروتکلی که برای استخراج RNA در سایت گذاشتیم عمل کنید در این مرحله کوچکترین استرسی نخواهید داشت…
حالا بریم سراغ بحث امروز… بررسی RNA استخراج شده عموما در دو جنبه انجام میشه…۱-بررسی کیفی ۲- بررسی کمی
با بررسی کیفی ما کیفیت RNA مون رو ارزیابی میکنیم در این مرحله اگر RNA ما دگرده شده باشه و یا کیفیت خوبی نداشته باشه روی ژل مشخص میشه…
در بررسی کمی ما غلظت RNA استخراجی مون رو بررسی میکنیم و بر طبق اون مقداری از RNA رو که باید برای سنتز cDNA برداریم محاسبه میکنیم…
حالا بریم هر مرحله رو جداگانه با هم بررسی کنیم…

اول بریم سراغ توضیح بررسی کیفی RNA:
یکی از راه های مشاهده ی کیفیت RNA استخراج شده ، Run کردن RNA روی ژل آگازور است. حواستون باشه درصد ژل اگاروز بسته به هدف شما و اینکه چه چیزی رو میخواین روش run کنین، متفاوته…

اگر هدفتون RUN کردن قطعات بزرگ و سنگینی مثل پلاسمید است باید درصد ژلتون ۰٫۷% باشه که برای ساختنش باید ۰٫۱۸۴g از پودر اگاروز رو در ۲۵ml بافر TAE 1X حل کنین…
اگر هدفتون run کردن قطعات DNA با طول متوسط هستش باید درصد ژلی که درست میکنین ۱% باشه که برای ساختنش باید ۲۳g از پودر اگارز رو در ۲۳ml بافر TAE 1X حل کنید…
و در نهایت اگر هدفتون run کردن قطعات کوتاهی از DNA و یا RNA است باید درصد ژلتون ۱٫۵% باشه که برای ساختنش باید ۰٫۳۴g از پودر اگارز رو در ۲۳ml بافر TAE 1X حل کنین…
پس متوجه شدین؟؟درصد ژلی که میسازین بسته به اندازه ی مولکولی که میخواین run کنین متفاوته و این خیلیییی مهمه…

صبر کنین هنوز طرز تهیه ی بافر TAE رو براتون نگفتم… در ابتدا شما باید یک استوک ۱۰X و یا ۵X از بافر TAE درست کنین و سپس ان را به ۱X تبدیل کنید..چرا؟؟؟چون هر بار درست کردن ان مشکل و وقت گیر است پس با یک استوک غلیط درست میکنیم و بعدش ان را رقیق مینماییم…
⁉حالا استوک اولیه ی بافر چطور درست میشه؟؟؟
برای تهیه ی استوک TAE 10X با PH=8.5 باید مقدار ۴/۴۸ گرم تریس بازی را به اضافه ۴/۱۳ میلی لیتر اسید استیک گلاسیال و ۷۴ گرم EDTA در آب مقطر دوبار تقطیر حل کرده حجم را به یک لیتر برسانید. این محلول در دمای اتاق نگهداری میشود…
حواستون باشه بعضی ازمایشگاه ها هم از بافر TBE استفاده میکنند که برای ساختن TBE 10X باید مقدار ۱۰۸ گرم تریس بازی را به اضافه ۵۵ گرم اسید بوریک و ۴۰ میلی لیتر EDTA نیم مولار با PH=8 در آب مقطر دوبار تقطیر حل کرده حجم را به یک لیتر برسانید و در دمای اتاق نگهداری کنید…
‼بین این دو بافر تفاوت چندانی وجود نداره شما میتونین بسته به امکانات ازمایشگاهتون از یکی از انها استفاده کنین…

خوب همونطور که گفتیم باید بافر ۱۰X تون رو ۱X کنین و بعد با پودر اگارز مخلوط کنین ( یه وقت یادتون نره!!!)
حالا برای run کردن RNA مقدار ۳۴g از پودر اگارز رو در ۲۳ml بافر حل میکنیم. برای حل شدن هر چه بهتر ظرف رو در ماکروویو قرار میدیم به مدت حدود ۱۰ ثانیه تا محلول شفاف بشه… حواستون باشه بخارات این محلول سمیه پس موقع استفاده از خودتون دور نگهش دارین…
بعد ار اینکه محلول کمی سرد شد اون رو در ظرف مخصوص ژل بریزین و شانه را نیز در ظرف بگذارید و صبر کنین تا ژل ببندد…سپس شانه را خارج کرده و ظرف مخصوص رو به تانک الکتروفورز که قبلا ان را با بافر TAE 1X پر کردین منتقل کنین…

نمایی از تانک الکتروفورز ، ظرف مخصوص ژل و شانه ها

خوب حالا میرسیم به مرحله ی اصلی و سخت کارمون …
برای انجام الکتروفورز ما نیاز به دو ماده ی loading dye و ladder داریم…
از loading dye برای رنگ دادن و سنگین کردن نمونه استفاده می کنیم. پس باید قبل از اینکه RNA را در چاهک ها run کنیم ابتدا باید مقداری از RNA ( در حدود ۳-۲ لاندا) را با ۱ لاندا loading dye مخلوط کنید و بعد به داخل چاهک ها بریزین. ( زیاد از رنگ استفاده نکنین چون نمونه تون سنگین میشه و حرکت نمیکنه)
از سوی دیگر ما نیاز به ladder داریم در اینجا نیز بسته به اینکه مولکول ما چه طولی دارد از ladder خاصی باید استفاده کنیم… ladder به ما کمک میکند تا طول مولکول run شده را متوجه بشیم . برای run کردن RNA معمولا از ladder هایی استفاده میکنیم که طولی بین ۲۰۰ تا ۱۰۰۰۰ base pair رو شناسایی میکنن.
حواستون باشه همیشه در هنگام ریختن مواد در چاهک ها، چاهک اول را رد کنین و از چاهک دوم شروع کنین چون ممکنه ژلتون گوشه اش پاره بشه پس بهتره در چاهک اول چیزی نریزین…
در چاهک دوم همیشه ladder رو بریزین تا بتونین به عنوان الگو ازش استفاده کنین
در چاهک های بعدی هم نمونه های RNA استخراج شده تون رو اضافه کنین…
دقت کنین سر سمپلر رو خیلی داخل نبرین تا ژل پاره بشه و از طرفی خیلی هم زود خارجش نکنین تا رنگ در بافر شناور بشه… کاملا با حوصله و بدون لرزش دست سر سمپلر رو داخل کرده و محلول رو داخل جاهک بریزین و بدون اینکه انگشتتون رو از بالای سمپلر بردارین به ارومی سمپلر رو خارج کنین… یکمی تجربه لازم داره اما با یکمی تمرین یاد میگیرین…

خوب مرحله ی سختش تموم شد حالا باید سیم های مثبت و منفی رو به دستگاه وصل کنین و دستگاه رو روشن کنین .بهتره ولتاژ دستگاه روی ۱۵۰ بذارین . حالا میبینین که حبابهایی در زیر دستگاه از قطب منفی به سمت قطب مثبت میره همین جریان RNA شما رو هم در دستگاه به حرکت در میاره.. در حدود نیم ساعت بعد دستگاه رو خاموش کنین.
حواستون باشه RNA ای که خلوص بالایی داره دو باند واضح بر روی ژل ایجاد میکنه… برای مشاهده ی دقیق ژل پس از run شدن ابتدا به مدت یک ربع ژل را در ظرف اتیدیوم بروماید قرار میدیم بعدش ان را در طرف محتوی اب به مدت چند دقیقه میشوریم و با دستگاه مخصوص زیر نور UV ژل رو به وضوح نگاه میکنیم…
موقع کار با اتیدیوم بروماید خیلی دقت کنین حتما دو تا دستکش بپوشین و بعدشم دستهاتون رو کامل بشورین چون اتیدیوم بروماید شدیدا سمی و سرطان زاست…

حالا میتونین این سوال رو جواب بدین که چرا برای RNA ما دو باند باید ببینیم؟؟؟ اصلا این دو تا باند چی هستن؟؟؟؟جواب اینه از ۲ باند مشاهده شده ی هر RNA یکی مربوط به ۲۸S rRNA است که به دلیل اینکه طول بیشتری دارد در بالا قرار می گیرد و دیگری باند ۱۸S rRNA است که چون طول کمتری دارد در پائین ژل می باشد. پس اینا در حقیقت rRNA های ما هستن که ما میبینیمشون.. اگر هر دوشون خوب و به اصطلاح sharp باشن یعنی ما RNA خوبی استخراج کردیم…

نمایی از ژل RNA در زیر دستگاه UVلازمه دقت کنین که دو باند باید کاملا sharp و مشخص باشند. هر باند باید در جایگاه طولی خودش باشه ( طول باند ۲۸s حدود ۵kb و باند ۱۸s در حدود ۱٫۹kb میباشد)
از طرفی شما نباید اسمیر ببینین چون باند های حاوی اسمیر به معنای دگرده شدن RNA شماست.. یعنی RNA شما خورد شده و نمیتونین ازش استفاده کنین…

در چاهک دوم RNA کاملا دگرده شده و نمیشه ازش استفاده کرد اما RNA چاهک سوم کاملا خوب و با کیفیته… به باند ها دقت کنین ببینین چقدر sharp و واضح هستن…

خوب دانشجویان و محققین عزیز خسته نباشین.. ما تا الان RNA مون رو استخراج کردیم.کیفیت اون رو با کمک الکتروفورز و ژل اگاروز سنجیدیم و دو تا باند sharp واضح دیدیم حالا باید بریم سراغ بررسی کمی RNA مون…
برای این کار زمان خیلی کمتری صرف میکنیم چون این کار رو دستگاه اسپکتروفتومتر Nanodrop برامون انجام میده…
این دستگاه چیکار میکنه؟؟؟ این دستگاه بدون نیاز به کووت و تنها با استفاده از ۱ الی ۲ میکرولیتر از نمونه قادر است در زمانی کمتر از ۱۰ ثانیه کلیه طول موجهای موجود در طیف مورد نظر را با دقت ۱ نانومتر ، اسکن نماید و غلظت یا جذب نوری ماده مورد نظر را نیز تعیین کند.

سخت شد؟؟؟ متوجه نشدین؟؟؟بذارین واضح تر بگم کاری که این دستگاه میکنه اینه که میتونه غلظت و خلوص اسید نوکلئیک یا پروتئین ما رو بر اساس مقدار جذب نوری در طول موج­های خاصی از اشعه گاما اندازه گیری کنه….

دستگاه نانودراپ

هنوز تموم نشده این دستگاه نه تنها میتونه غلظت RNA استخراجی ما رو بگه بلکه میتونه به ما نشون بده که چقدر تمیز کار کردیم!!!
⁉چطوری؟؟؟ به این صورت که اگر در نمونه ی RNA ی ما وآلودگی پروتئینی، آلودگی به حلال های آلی و نمک­ های و کربوهیدرات­ها وجود داشته باشه میزان جذب به طور معنی داری تغییر می کند.

حالا ما چطوری این رو بفهمیم؟؟؟ محاسبه نسبت جذب ۲۶۰ به ۲۸۰ و نسبت ۲۶۰ به ۲۳۰ تعیین کننده خلوص اسیدهای نوکلئیک استخراجی می باشد.
برای نمونه­ های RNA نسبت ۲۶۰به ۲۸۰ برابر ۱±۲ و برای نمونه ­ها DNA نسبت ۲۶۰ به ۲۸۰ برابر ۱± ۱٫۸ قابل قبول است. غلظت ۲۶۰ به ۲۸۰ پائین­تر از ۱٫۸ عموماً نشان­دهنده آلودگی پروتئین در طی مراحل استخراج می­ باشد.
نترسین این اعداد رو خود دستگاه به شما میده و شما فقط باید بدونین هر نسبت چه معنایی داره!!!!

همیشه گفتم بازم میگم هیچ محققی بی دلیل چیزی رو قبول نمیکنه پس الان باید این سوال براتون پیش بیاد که این نسبت ها چی هستن؟؟؟ چرا این اعداد گویای ناخالصی محصول ما هستن؟؟؟
جوابش اینه جذب در طول موج ۲۶۰ نانومتر به تنهایی اطلاعات کمی را در زمینه خلوص و کیفیت نمونه فراهم می کند. یکی از مشکلات در استخراج RNA و DNA حذف ناکامل پروتئین­ها از عصاره سلولی می باشد. پروتئین جذب در طول موج ۲۸۰ را افزایش می­دهد ، بنابراین نسبت ۲۶۰ به ۲۸۰ کاهش می­ یابد و خلوص RNA از بین می رود. پس نسبت طول موج ۲۶۰/۲۸۰ بايد حدود ۱٫۸ الي ۲ باشد و نسبت هاي کمتر از ۱٫۵ جهت ادامه کار مناسب نيستند.

طول موج ۲۳۰ مربوط به آلودگي به فنول، اتانول و ايزوپروپانول است . . در شرايط ايده آل بايستي ميزان آلودگي با پروتئين، فنل و اتانول بسيار کم باشد. به عبارت ديگر بايستي نسبت طول موج۲۶۰/۲۳۰ بالاتر از ۱ و در حدود۱٫۸ الي ۲ باشد، مقادير پايينتر از ۱ نامطلوب است و بهتر است بر روي چنين نمونه اي کار نشود.
خوب مرحله ی بررسی کمی و کیفی RNA ای که استخراج کردیم هم تموم شد.. خسته نباشین… حالا اگر میخواین روش کار با دستگاه نانودراپ رو ببینین حتما یک سری به کانالمون بزنین اونجا از تمام مراحل کار کلیپ های اموزشی براتون گذاشتیم…

print

Tags: , ,


3 دیدگاه

  • فرزانه says:

    ممنونم خیلی برای من مفید بود همه توضیحات تون به سوالاتم کامل پاسخ داد

  • ارغوان says:

    سلام. ممنون از سایت عالی تون .
    سوالی که برام پیش اومده اینه که بقیه RNA ها روی ژل دیده نمیشن؟ mRNA استخراجی چطور دیده میشه ؟

  • علی says:

    قسمت استفاده از اتیدیوم بروماید را واضح توضیح ندادید. نمیشه بجای روشی که گفتین یک میکرولیتر اتیدیوم بروماید را داخل ظرف حاوی TBE و پودر اگاروز که از ماکروویو خارج کردیم بریزیم؟

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

دو × 1 =