ایمونوهیستوشیمی

ایمونوهیستوشیمی (IHC) ترکیبی از تکنیک‌های ایمونولوژی، بافت‌شناسی و بیوشیمیایی است که برای تشخیص اختصاصی اجزای (آنتی‌ژن‌های پروتئینی) بافت‌ها، بواسطه آنتی‌بادی‌های کنژوگه شده از طریق یک واکنش آنتی‌ژن- آنتی‌بادی، استفاده می‌شود . تا سال ۱۹۴۱ تشخیص آنتی‌ژن‌ها در سطوح بافتی امکان‌پذیر نبود، و در این سال Dr. Albert Coons ابتدا این تکنیک ایمونوفلورسانس را مطرح، و سپس آنرا اجرایی کرد. در دهه‌های اخیر توانایی تشخیص آنتی‌ژن‌ها در برش‌های بافتی به سرعت بهبود و افزایش یافته است . ایمونوهیستوشیمی (IHC) یک تکنیک رنگ‌آمیزی است که برای اندازه‌گیری کمی و کیفی میزان بیان آنتی‌ژن‌های پروتئینی در نمونه‌های بیولوژیک و بافتی، بواسطه اتصال آنتی‌بادی اختصاصی به آنتی‌ژن هدف، کاربرد دارد.

فیکس کردن:
– به مدت ۱۰-۷ روز در محلول محلول پارافرمالدئید ۴% در بافرفسفات ۰٫۱ مولار در دمای ۴درجه
– یک شبانه روز محلول سوکروز ۱۰%
– یک شبانه روز محلول سوکروز ۲۰%
– یک شبانه روز محلول سوکروز ۳۰%

قالب گیری:
– نمونه‌ها با چسب OCT قالب گیری شده و تا زمان برش در دمای منفی ۲۰ نگهداری میشوند.
برش گیری:
پس از قالب گیری، نمونه‌ها با برش‌های عرضی و ضخامت ۲۰ میکرون توسط دستگاه کرایواستات برش گرفته شد. پس ازانتقال برش‌ها برروی اسلاید‌های سیلانه سریعاً توسط استن فیکس مجدد شده ودردمای C20- نگهداری شدند.

ایمونوهیستوشیمی
۱٫ برش‌ها را بمدت ۵ دقیقه با Tris- buffered saline (TBS) شستشو می دهیم.
۲٫ برای بلاک کردن پراکسیداز اندوژنوس، لامها بمدت ۱۰ دقیقه در تاریکی در محلول H2O2/Methanol قرار می‌دهیم. آب اکسیژنه را با نسبت ۱۰/۱ در متانول حل کردیم.
۳٫ به مدت ۳۰ دقیقه در درجه حرارت اتاق با ۰٫۲۵% Triton X-100 انکوبه می کنیم تانفود آنتی بادی‌های اولیه درآن زیاد شود.
۴٫ سپس مرحله blocking با بکارگیری+ ۵% normal goat 0.3% bovin serum albumin (BSA) به مدت یک ساعت در درجه حرارت اتاق نمونه‌ها انکوبه می‌کنیم.
۵٫ جهت رنگ کردن برشها آن‌هارا با آنتی بادی اولیه که با رقیق‌کننده مخصوص خود رقیق شده بمدت ۴۸ ساعت دردمای ۴درجه انکوبه می‌کنیم.
۶٫ شستشو با TBS سه بار، هر بار ۵ دقیقه
۷. اضافه کردن آنتی بادی ثانویه رقیق شده کونژوگه با HRP، به مدت ۱ ساعت در دمای اتاق
۸٫ شستشو با TBS سه بار، هر بار ۵ دقیقه
۹. سپس با DAB (3.3-diaminobenzidine) در تاریکی بمدت ۱۰ دقیقه برای آشکار سازی کمپلکس آنتی ژن – آنتی بادی انکوبه می کنیم.
۱۰. شستشو با TBS سه بار، هر بار ۵ دقیقه
۱۱. سپس Counterstained هسته با هماتوکسیلین به مدت ۳۰ ثانیه.
۱۲. مرحله دهیدر اتاسیون شامل عبور از محلولهای ذیل را انجام می دهیم:
a. اتانول ۹۵% (۲ ظرف)، (هر کدام ۱۵ ثانیه)،
b. اتانول ۱۰۰%
c. گزیلل A به مدت ۵ دقیقه
d. گزیلل B به مدت ۵ دقیقه
۱۳. مونته کردن (انتلان) و گذاشتن لامل برروی لام
۱۴. مشاهده با میکروسکوپ نوری

 برای کنترل منفی: تمامی مراحل بالا انجام گردید فقط با آنتی بادی اولیه انکوباسیون انجام نشده و به جای آن ۱۰۰ میکرولیتر Tris wash buffer استفاده می شود.
طرز تهیه BSA: 0.05گرم از BSA را در ۵۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر حل می کنیم بعد بخوبی بهم زده تا حل شود، محلول نهایی، محلول BSA 100 MG/L می باشد.

طرز سیلانه کردن لام‌ها:
لام‌های شیشه ای نو را در سبد‌های مخصوص چیده و به ترتیب محلول‌های زیررا می گذرانیم.
۱٫ قرار دادن لام‌ها در استون به مدت ۲ دقیقه
۲٫ قرار دادن لام‌ها در محلول سیلان و استون به مدت ۵ دقیقه
۳٫ خشک شدن لام‌ها در هوا
۴٫ شستشو کردن لام‌ها در آب مقطر در حد فرو بردن
۵٫ خشک شدن لام‌ها در هوا
۶٫ قرار دادن لام‌ها در جعبه لام تا گرد و غبار روی آن‌ها ننشیند.

 روش تهیه محلول سیلان و استون : CC2 سیلان را در CC98 استون حل می نماییم.