بررسی بیان ژن

طي سالها روشهاي مرسوم براي بررسي بيان ژنها لکه گذاري نوترون (Northern blot) ، هيبريداسيون درجا(In Situ Hybridization) بوده است. اگر چه هنوز اين روشها به طور گسترده استفاده مي شوند ولي اکثر آنها وقت گير بوده و حساسيت نسبتا پايين دارند که باعث مي شود تشخيص نسخه هاي RNA کم، مشکل و يا غير ممکن شود.
واکنش زنجيره‌اي پلي مراز يا PCR تکنيکي علمي در زيست‌شناسي مولکولي است که انقلابي در دانش و فناوري هاي زيست مولکولي ايجاد کرد. اين تکنيک در سال ۱۹۸۴ توسط کري موليس بيوشيميست آمريکايي ابداع گرديد و در سال ۱۹۹۳ ، موليس جايزه نوبل شيمي را به خاطر اين ابداع دريافت کرد.
PCR تکنيکي براي تکثير ميليوني يک يا نسخه‌هاي اندكي از يک قطعه DNA است. اساس PCR استفاده از توانايي آنزيم DNA پليمراز براي سنتز رشته‌هاي جديد DNA است که همانند رشته الگو هستند. PCR، در حال حاضر روش معمول و در اغلب موارد ضروري در آزمايشگاههاي پژوهشي پزشکي و زيستي است و براي انواع برنامه‌هاي کاربردي از جمله همسانه سازي ، تعيين توالي DNA ، ترسيم درخت ژنتيکي يا علم بررسي تکامل موجودات، آناليز عملکرد ژن‌ها، تشخيص بيماري‌هاي ژنتيکي، تعيين اثر انگشت DNA (که در پزشکي قانوني و آزمون نسبيت استفاده مي‌شود) ، و تشخيص آلودگي ها و عفونت‌هاي ويروسي مورد استفاده مي باشد. اساسا از PCR براي بدست آوردن اطلاعات کمي و کيفي استفاده مي شود. توانايي PCR معمولي در بدست آوردن اطلاعات کيفي (Qualitative) غير قابل انکار است. از آنجايي که پرايمر هاي مورد استفاده در PCR اختصاصي هستند، تنها DNA مورد نظر تکثير مي شود و بدين ترتيب مقادير بسيار ناچيز از توالي مورد نظر شناسايي مي شود. بنابراين PCR معمولي از نظر تعيين وجود يا عدم وجود توالي خاص بسيار کارا محسوب مي شود. PCR مزاياي زيادي دارد که باعث گسترش استفاده آن در آزمايشگاه ها شده است. سرعت، سادگي، قيمت مناسب و… از مزاياي PCR محسوب مي شود.

مراحل كلي واکنش زنجيره اي پلي مراز يا PCR به شرح زير مي‌باشد:

۱٫ مرحله واسرشته سازي: اين مرحله اولين مرحله معمول PCR بوده و شامل گرم کردن محيط به ميزان ۹۸-۹۴ درجه سانتيگراد به مدت ۳۰-۲۰ ثانيه است. اين عمل باعث ذوب شدن DNA (جدا شدن دو رشته DNA از همديگر) هم DNA الگو و هم پرايمر از طريق گسستن پيوندهاي هيدروژني بين نوکلئوتيدهاي دورشتهDNA ،و توليد DNAتک رشته‌اي مي‌شود.
۲٫ مرحله اتصال : در اين مرحله دماي واکنش به ۶۵-۵۰ درجه سانتيگراد به مدت ۴۰-۲۰ ثانيه کاهش مي يابد تا امکان اتصال DNA پليمراز و پرايمر به DNAالگوي نوع تک رشته‌اي فراهم شود.
۳٫ مرحله گسترش يا طويل شدن : درجه حرارت اين مرحله به آنزيم پليمراز و درجه حرارت بهينه فعاليت آن بستگي دارد. بطور مثال، آنزيم Taqپليمراز در درجه حرارت ۸۰-۷۵ درجه سانتيگراد فعاليت قابل قبول دارد. در اين مرحله پليمراز نوکلئوتيدهاي مکمل را بر اساس رشته الگو از ۵’به۳’ در کنار هم قرار داده و در نهايت، رشته مکمل را توليد مي کند. مدت زمان اين مرحله به آنزيم پليمراز و طول رشته DNA الگو بستگي دارد.

طراحي پرايمر
ويژگي‏هاي يک پرايمر به صورت زير است:
۱٫ طول پرايمر بايد بين ۱۹ تا ۴۰ نوکلئوئيد (در حالت بهينه بين ۲۰ تا ۲۵ نونکلئوئيد) باشد.
۲٫ دماي هيپريداسيون پرايمرها Tm بايد بين ۵۸ تا ۶۰ درجه سانتي گراد باشد.
۳٫ درصد CG پرايمرها بايد بين ۸۰-۳۰ درصد باشد (که مقدار بهينه ۵۵-۴۵%) است.
۴٫ طول قطعه تکثيري ۱۵۰-۱۰۰ نوکلئوتيد بايد باشد يعني پرايمر معکوس ۱۵۰-۱۰۰ نوکلئوتيد پائين دست بايد انتخاب شود.
۵٫ در ۵ نوکلئوئيد انتهايي، بيش از دو نوکئوتيد C يا G وجود نداشته باشد.
۶٫ در توالي پرايمرها بيش از ۳ نوکئوتيد G پشت سر هم قرار نگرفته باشد.
۷٫ پرايمرها فاقد ساختار ثانويه، پرايمر دايمر و سنجاق سر باشد.
۸٫ اختلاف Tm پرايمرها حداکثر ۵% درجه سانتي گراد باشد.
پرايمرهاي سفارشي به صورت ليوفيليزه مي¬باشد، پس از ذوب پرايمرها در دماي اتاق و سانتريفوژ مختصر آن‌ها، مقداري آب ديونيزه (ساخت شرکت سازنده) به پرايمرها اضافه مي‏شود.تا غلظت به دست آيد سپس پرايمرها در فريزر ۲۰- نگهداري مي¬شود.
چنانچه میخواهیم پرايمر ها براي RT-PCR استفاده شوند، به صورت Exon-Exon junction طراحي میشوند.. در واقع اين پرايمر ها توانايي اتصال به توالي هاي DNA را نداشته و تنها به cDNA متصل مي شوند. بدين ترتيب وجود DNA در درون نمونه موجب پديد آمدن خطا در کميت سنجي RNA نمي گردد.
پرايمر ها میتوانند به کمک برنامه Primer3Plus طراحي شده و با برنامه‌هاي OligoAnalyzer و Primer-Blast/ NCBI چک شوند.

واكنش Reverse Transcription-PCR)RT-PCR)
PCR يک راه سريع و حساس براي بررسي بيان يک ژن است و اطلاعات نيمه کمي درباره ميران بيان مي دهد. بدين منظور از Taq DNA Polymerase 2x Master Mix Red براي انجام RT-PCR استفاده می گردد.

برای اطلاعات کامل تر و توضیحات دقیق تر به قسمت وبلاگ مبحث PCR مراجعه فرمایید

print
Tags: , ,


۱ دیدگاه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

پانزده − هشت =