تعیین کیفی و کمی پلاسمید های استخراج شده

الکتروفورز نمونه های پلاسمید استخراج شده با ژل آگاروز

مواد لازم برای الکتروفورز ژل آگاروز
 بافر TBE (8= pH )
 بافر Loading
 رنگ اتیدیوم بروماید (mg/ml 5/0)
 پودر آگارز
 شاخص وزن مولکولی ( bp 100 )
 قالب ژل و شانه مخصوص
 منبع تغذیه الکتریکی (Power supply)
 تانک الکتروفورز افقی
 دستگاه ترانس لومیناتور یا UV doc

طرز تهیه ۱ لیتر بافر (Tris-borate) 5X TBE

ابتداg 54 از Tris base وg 5/27 از Boric acid را در ظرف مناسب می ریزیم و به آن ml 20 ، EDTA 0/5 M با ۸=pH اضافه کرده و سپس حجم محلول را توسط آب مقطر به ۱ لیتر می رسا نیم و پس از آنکه خوب حل شد در دمای اتاق نگه داری می کنیم. (هنگام استفاده آن را با آب مقطر ۱۰ بار رقیق می کنیم).
طرز تهیه رنگ اتیدیوم بروماید(O.5 mg/ml)
۵۰mg از پودر اتیدیوم بروماید را در ml 100 آب استریل حل می کنیم.
روش کار برای سوار کردن نمونه ها روی ژل آگاروز
ابتدا شانه را در داخل قاب مخصوص دستگاه قرار می دهیم، مقدار g 5/0 پودر آگارز را به ml 50 بافر X5/0 TBE اضافه کرده و با حرارت دادن در دستگاه ماکروفر، آگاروز کاملا حل می شود. آگاروز مذاب را به آرامی در قالب ژل ریخته و پس از بسته شدن کامل ژل و برداشتن شانه، نمونه های DNA را پس از مخلوط کردن با بافر Loading داخل چاهک های ژل می ریزیم. تانک الکتروفوز را به منبع تغذیه وصل می کنیم. با پایان یافتن الکتروفورز و تفکیک باندها، ژل را درون تانک حاوی اتیدیوم بروماید انداخته و پس از ۱۰ دقیقه باندهای DNA را توسط دستگاه ترانس لومیناتور یا UV Doc مشاهده و عکس برداری می کنیم.

بررسی غلظت و خلوص DNA به وسیله اسپکتروفوتومتر
پس از استخراج پلاسمید و بارگذاری نمونه ها روی ژل آگاروز لازم است غلظت نمونه ها توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر تعیین شود.

مواد لازم برای بررسی غلظت و خلوص DNA به وسیله اسپکتروفوتومتر
 حلالی که DNA پلاسمیدی رو در ان حل کردیم مانند اب DEPC و یا بافر TE
 اسپکتروفوتومتر UV
 کووت کوارتزی

روش کار
ابتدا دستگاه اسپکتروفوتومتر با حلالی که نکونه را در ان حل کرده ایم صفر و سپس نمونه DNA پلاسمیدی استخراج شده را با حلال استریل به نسبت ۱:۱۰۰ رقیق می کنیم. به وسیله دستگاه اسپکتروفوتومتر جذب نوری نمونه ها را در طول موج های ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر اندازه گیری می کنیم. برای تعیین غلظت و خلوص DNA از این فرمول استفاده می کنیم :
۵۰ ×۵۰۰ ×OD260 nm (g/µlµ) غلظت DNA

برای اطلاعات بیشتر در این زمینه به قسمت وبلاگ مبحث تعیین کیفی و کمی RNA استخراج شده مراجعه فرمایید.

print

Tags: , , ,


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

1 × یک =