ترانسفورماسیون باکتری اشرشیاکلی سویه ی DH5α

مقدار ۱µg از DNA پلاسمیدی به ۵۰ µL از سلول مستعد اضافه میکنیم، سپس به مدت ۳۰ دقیقه روی یخ قرار داده میشود. پس از آن به مدت ۲ دقیقه روی هات بلاک با دمای ℃۴۲ قرارمیگیرد. هدف از اینکار ایجاد شوک حرارتی در سلولها است. سپس مجددا میکروتیوپ به مدت ۲ دقیقه روی یخ قرار داده شده و بدنبال آن مقدار ۱ml محیط کشت LB مایع به آن اضافه و به مدت ۱ ساعت در انکوباتور شیکردار ℃۳۷ با دور ۱۸۰ rpm انکوبه میشود تا باکتری ها در آن رشد کنند. پس از اتمام این زمان، میکروتیوپ از انکوباتور خارج و به مدت ۱۰ دقیقه با دور ۶۰۰۰rpm سانتریفیوژ شده تا باکتری ها رسوب کنند. بیشتر مایع رویی خارج و رسوب باکتریایی در باقیمانده ی مایع رویی(حدود۱۰۰ µL ) حل شده و مقدار ۵ الی ۱۰ میکرولیتر از آن برداشته و بوسیله ی لوپ استریل روی پلیت حاوی محیط کشت LB جامد شامل آنتی بیوتیکی که باکتری به ان بواسطه ی وجود پلاسمید ترانسفرم شده حساس نیست ، کشت داده شده و به مدت ۱۶ ساعت در انکوباتور ℃۳۷ انکوبه می گردد.

انتخاب سلول های ترانسفورم شده
فقط سلول های ترانسفورم شده توانایی رشد در پلیت حاوی آنتی بیوتیک را دارند. هدف از این کار غربالگری سلول های ترانسفورم شده از ترانسفورم نشده هاست و ژن مقاومت به آنتی بیوتیک مربوطه که در پلاسمید حمل می شود، نوعی مارکر شناساگر به حساب می آید. در واقع مارکر ژنی است که یک خصوصیت متمایز به سلول های ترانسفورم شده می بخشد و آنها را قابل شناسایی از انواع ترانسفورم نشده می کند. ژن شناساگر معمولا ژن مقاومت به یک آنتی بیوتیک یا ژن کدکننده ی یک آنزیم خاص است که فعالیت آن از طریق ایجاد یک رنگ یا یک ماده ی خاص قابل تشخیص باشد. شناساگرهای ژنی مورد استفاده در این تحقیق شامل ژن های مقاومت به آنتی بیوتیک های آمپی سیلین و کانامایسین می باشد که در پلاسمیدهای موردنظر قرار داده شده اند و سلول های ترانسفورم شده با هر پلاسمید، بوسیله ی آنتی بیوتیک مربوطه غربال می شوند.

بررسی سریع پلاسمیدهای ترانسفورم شده با استفاده از بافر کرکینگ
برای اطمینان از حضور پلاسمید مربوطه در باکتری های ترانسفورم شده علاوه بر غربال باکتری ها با استفاده از مارکر ژنی، می توان با استفاده از یک روش سریع باکتری را لیز کرده و از حضور پلاسمید موردنظر در آن اطمینان حاصل کرد. برای اینکار ابتدا به طور تصادفی چندین تک کلونی از پلیت حاوی کلونی های باکتری ترانسفورم شده، برداشته شده و هرکدام جداگانه به ۵ml محیط کشت LB حاوی آنتی بیوتیک مربوطه انتقال داده شده و به مدت ۱۶ ساعت در انکوباتور شیکردار ۳۷ درجه با دور ۱۸۰ rpm قرار داده می شوند. سپس مقدار ۲ml از آن سانتریفیوژ شده و پس از خارج کردن مایع رویی مقدار ۱۰۰µL از بافر کرکینگ به رسوب اضافه شده و شدیدا ورتکس می شود تا رسوب در آن حل شده و سپس به مدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق انکوبه می شود تا بافر مذکور سلول ها را لیز کند. پس از آن به مدت ۱۵ دقیقه با دور ۱۲۰۰۰ rpm سانتریفیوژ می شود تا اجزای سلولی و پروتئین های باکتریایی رسوب کنند. نهایتا مقدار ۱۰ الی ۲۰ میکرولیتر از مایع رویی، که حاوی اسیدهای نوکلئیک است، روی ژل آگاروز ۷/۰ % بارگذاری می شود تا با دیده شدن پلاسمیدهای موردنظر روی ژل صحت انجام ترانسفورماسیون تأیید گردد.

تهیه ی استوک از باکتری های ترانسفورم شده
پس از اطمینان از صحت ترانسفورماسیون باکتری ها با پلاسمیدهای مورد نظر، برای نگهداری طولانی مدت، از آنها استوک تهیه شده و در فریزر ۷۰- درجه ذخیره می شوند.
ابتدا چندین تک کلون از باکتری ترانسفورم شده ی حاوی پلاسمید مورد نظر در شرایط استریل، در ml 5 محیط کشت LB مایع حاوی µg/ml 100 آنتی بیوتیک مربوطه کشت داده شده و به مدت ۱۶ ساعت (Over night) در انکوباتور با دمای ℃ ۳۷ و با دور ۱۸۰ rpm انکوبه می شوند. سپس ۷۰۰ µL از باکتری رشدیافته به همراه ۳۰۰ µL گلیسرول ۱۰۰% استریل (اتوکلاو شده) در یک میکروتیوپ استریل ریخته شده و بوسیله ی ورتکس به خوبی مخلوط میشوند تا گلیسرول به خوبی با سلول های باکتریایی مخلوط شده و یک مخلوط همگن بدست آید. به این ترتیب هر استوک باکتری حجمی معادل ۱ ml خواهد داشت. در این استوک گلیسرول نقش ضدیخ را بازی میکند و از ایجاد کریستال های یخ در داخل سلول باکتری و در نتیجه مرگ آن ها جلوگیری می کند. سپس میکروتیوپ های تهیه شده سریعا به فریزر ℃۷۰- منتقل می شوند تا برای مدت طولانی محفوظ بمانند.

دوستان همراه اگر به اطلاعات کامل و واضح تری در زمینه ی ترانسفورماسیون نیاز دارین لطفا به قسمت وبلاگ مبحث ترانسفورماسیون مراجعه فرمایید.

print
Tags: ,


۱ دیدگاه

  • سارا نوری says:

    سلام
    ممنون از مطالب خوبیون. یک سوال در مورد بافر کرکینگ داشتم. امکان داره توضیحات بیشتری در موردش بفرمایید که اصلا پی هست و مواد تشکیل دهنده اش شامل چیست.
    با سپاس

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

شش − سه =