ساخت سلول های باکتریایی مستعد

برای ساخت باکتری های مستعد به منظور ترانسفورماسیون آن ها با DNA پلاسمیدی خارجی، از دو محلول CaCl2 100Mm و MgCl2 50mM با هدف ایجاد نفوذپذیری در غشای سیتوپلاسمی، و محلول CaCl2 100Mm 15% Glycerol با هدف حفظ و نگهداری سلول های مستعد شده در فریزر ۷۰- درجه استفاده می شود که این روش اصطلاحا به روش کلرید کلسیم معروف است. هر کدام از این محلولها پس از آماده سازی، اتوکلاو شده و در شرایط استریل در دمای ۴ درجه در یخچال تا زمان مصرف نگهداری می شوند.
ترانسفورماسیون به صورت مصنوعی با روشهای فیزیکی و شیمیایی که مبتنی بر افزایش نفوذپذیری غشای سلول میزبان هستند، امکان پذیر است. در سال ۱۹۷۲ دانشمندان دریافتند که تیمار باکتری E.coli با CaCL2 منجر به مستعد سازی این سلول در پذیرش DNA خارجی می شود. از آن زمان به بعد این روش به عنوان یک روش شیمیایی مناسب برای مستعد کردن باکتری E.coli مورد استفاده قرار می گیرد. عمده باکتری هایی که به عنوان میزبان برای ترانسفورماسیون پلاسمید های مختلف استفاده میشوند ، سویه های DH5α و TOP10 از خانواده ی E.coli می باشند. ترانسفورماسیون این سلول ها با پلاسمیدهای موردنظر، مستلزم مستعد کردن سلولهای مزبور از طریق افزایش نفوذپذیری غشای آنها بود. بدین منظور از روش شیمیایی کلسیم فسفات بهره گرفته شد. مراحل کار در زیر به تفصیل آمده است:

مواد لازم براي ساخت سلولهای شایسته
 باکتری E.Coli سویه DH5α و یا TOP10
 انکوباتور شيکردار
 محیط کشت LB مایع
 محیط کشت LB جامد
 محلول کلسیم کلراید ۰٫۱ Mm که حتما باید فیلتر یا اتوکلاو شود.
 محلول mgcl2 0.1Mm که باید فیلتر یا اتوکلاو شود.
 محلول کلسیم کلراید ۰٫۱ mM همراه با گلیسرول ۲۰%

روش کار:
ابتدا با استفاده از لوپ استریل در شرایط استریل(زیر هود میکروبی یا در کنار شعله)، مقداری از باکتری نگه داشته شده در ℃ ٧٠- برداشته را و روی پلیت تازه حاوی محیط جامد LB کشت داده شده و سپس به مدت ۱۶ ساعت (Over night) در انکوباتور ℃۳۷ انکوبه می شود تا کلونی های باکتری روی پلیت پدیدار شوند. یکی از کلونی های تک رشد یافته روی پلیت، به ۵ ml محیط مایع LB منتقل شده و حدود ۱۶ ساعت در انکوباتور ℃ ۳۷ شیکردار با دور rpm180 قرار داده می شود. سپس این باکتری های رشد یافته به ۵۰ ml محیط مایع LB واقع در یک ارلن ۲۵۰ ml منتقل شده و حدود ۳ ساعت در انکوباتور شیکردار ℃ ۳۷ با دور rpm180 انکوبه می شوند. باکتری هایی مورد نیاز برای ساختن سلول های مستعد باید در فاز رشد لگاریتمی باشند و به همین دلیل مدت زمان انکوبه کردن آن ها کوتاه است و در این مدت به طور متوالی غلظت آن ها توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر در طول موج ۶۲۰ نانومتر اندازه گیری می شود تا زمانی که جذب نوری آنها به حدود ۰٫۵ برسد. در این زمان اکثر باکتری ها در فاز لگاریتمی بوده و شرایط بهینه را برای تهیه ی سلول های مستعد دارند. پس از رسیدن جذب نوری باکتری ها به مقدار مذکور، ارلن از انکوباتور خارج شده و محتوی آن به دو فالکون ۵۰ ml استریل سرد با مقادیر یکسان خالی شده و سپس به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۴ ℃ و با دور ۴۰۰۰ rpm سانتریفوژ می شوند.
پس از خارج کردن محیط رویی، به رسوب باکتریایی موجود در هر فالکون، مقدار ۱۰ml از محلول سرد CaCl2 100Mm اضافه شده سپس رسوب در آن حل شده و به مدت ۱۰ دقیقه روی یخ قرار داده می شود و مجددا به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ℃۴ و با دور ۴۰۰۰ rpm سانتریفوژ می شوند. پس از اتمام سانتریفیوژ محلول رویی خارج گشته و این بار مقدار ۱۰ml از محلول سرد MgCl2 50mM به آن اضافه شده رسوب در آن حل شده و مجددا به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ℃۴و با دور rpm 4000 سانتریفوژ می شوند.(میتوان به حای محلول mgcl2 مجدد از محلول cacl2 استفاده کرد). پس از اتمام زمان سانتریفوژ مایع رویی خارج گردیده و رسوب در ۲mlمحلول CaCl2 100Mm 15% Glycerol به آرامی حل شده و سپس سوسپانسیون به دست آمده به مدت نیم ساعت روی یخ نگه داشته می شود. حال باکتری های به دست آمده در حجم های ۵۰-۱۰۰µL در میکروتیوپ های استریل ml 1.5تقسیم شده و برای ماندگاری طولانی مدت در فریزر ℃-۷۰ نگه داری می شوند. این سلول ها، سلول های مستعد (competent cells) هستند و دیواره آنها در مقایسه با باکتری های تیمار نشده، قدرت نفوذ پذیری بیشتری برای ورود DNA خارجی دارد.

برای اطلاعات بیشتر به قسمت وبلاگ مبحث ساخت باکتری مستعد مراجعه فرمایید.

print
Tags: , ,


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

سیزده − 5 =