روش های مورد استفاده در کشت سلولی

پاساژ سلول

مواد لازم( برای فلاسک های T25):
PBS(1X) 2ml
تریپسین ۲۵/۰ % ۲ml
محیط کشت حاوی سرم ۴ -۵ ml
فالکون ۱۵ml استریل به تعداد رده های سلولی
فلاسک T 25 فیلتردار به تعداد رده های سلولی

لازم به ذکر است برای رده های سلولی که رشد زیاد دارند ار فلاسک های T75 استفاده میشود که در اینصورت حجم محیط مشت داخل فلاسک ۹-۱۰ ml خواهد بود.
روش کار: سلول زمانی که تراکمش در فلاسک زیاد شود و دیگر جایی برای رشد و تکثیر نداشته باشد باید مکانش عوض شود. در غیر این صورت شروع به مردن می کند.در گام نخست سلول ها زیر هود توسط ۲ ml PBS شسته می شوند تا سلول های مرده ی آنها از فلاسک خارج شود. سپس توسط تریپسین ۲۵/۰ % با فشار زیاد از سطح فلاسک کنده می شوند برای این کار باید بعد از اضافه کردن تریپسین به مدت ۴-۳ دقیقه در انکوباتور قرار بگیرند. پس از کنده شدن سلول ها برای خنثی کردن اثر تریپسین به فلاسک ۴ ml محیط کشت و دارای سرم ۱۰% اضافه می شود. کل محتویات فلاسک به فالکون ۱۵ استریل منتقل شده و توسط سانتریفوژ با با دور ۱۰۰۰ در دقیقه سانتریفور می شود. حال محلول رویی را دور ریخته و به پلیت کف فالکون۱ ml محیط کشت دارای سرم اضافه می کنیم و به خوبی پیپتاژ می نمائیم. حال با توجه به تراکم معمولی در فلاسک، مقدار مناسبی از سلول را وارد فلاسک های فیلتر دار پر شده با ۶ ml محیط کشت دارای سرم می نمائیم.

تعویض محیط کشت:
با توجه به رشد سلول باید هر ۲۴ تا ۴۸ ساعت یکبار محیط درون فلاسک تعویض شود. به دلیل وجود فنل رد در محیط کشت سنجش pH به راحتی صورت می گیرد. سلول ها در اثر تکثیر یکسری مواد سمی و دفعی از خود ایجاد می کنند که سبب زرد شدن محیط می شود این مواد pH محیط را کم کرده و محیط را اسیدی می کنند. باید برای ادامه ی رشد سلول این مواد از فلاسک خارج شوند. اما به خاطر داشته باشیم که نباید همه ی محیط کشت خارج شود. ۱ml تا ۲ ml محیط بدلیل دارا بودن فاکتورهای رشدی که سلول تولید کرده باید در فلاسک باقی بماند.

شمارش سلول ها با لام هموسیتومتر
تعیین تعداد سلول ها در کشت، برای استاندارد کردن شرایط کشت و ایجاد دقت در آزمون و تکنیک های کمی، دارای اهمیت می باشد. یکی از روش های بسیار متداول استفاده از لام هموسیتومتر و شمارش تعداد سلول های زنده در زیر میکروسکوپ معکوس است. لام هموسیتومتر یک صفحه ی اسلایدی ضخیم شیشه ای با یک ناحیه ی مرکزی طراحی شده به عنوان چاهک شمارش می باشد. در این قسمت دو شبکه که هرکدام شامل پنج مربع هستند وجود دارد.در زیر نمایی از یک لام نئوبار قابل مشاهده است.

روش شمارش سلول ها:

ابتدا سلول ها را توسط تریپسین از کف فلاسک کنده و با سانژیفوژ محلول رویی را دور ریخته و به رسوبات کف فلاسک ۱ ml محیط کشت با سرم اضافه کرده سپس توسط پیپتاژ کردن یک سوسپانسیون یکنواخت از سلول ها به وجود می آوریم. حال سطح لام هموسیتومتر را با الکل ۷۰% کاملاً تمیز و خشک می کنیم. حال ۱۰ μL از سوسپانسون سلولی برداشته و با ۱۰ μL از محلول تریپان بلو ۰٫۰۰۴ ترکیب می کنیم. با پیپتاژ کاملاً سلول ها را به رنگ آغشته می کنیم. تریپان بلو نوعی رنگ حیاتی است که قادر می باشد از طریق غشای سلول های مرده وارد شده و سلول ها را رنگ کند. حال یک لامل تمیز روی لام قرار داده و از زیر لامل ۱۰ μL از سوسپانسیون آغشته به رنگ را وارد لام می کنیم. به طوریکه سطح زیر لامل کاملاً پر و یک دست شود. حال لام را زیر میکروسکوپ گذاشته و چهارخانه ی w_1 و w_2 و w_3 و w_4 را شمارش می کنیم.
حال میانگین تعداد سلول ها در ۴ خانه را در ضریب ثابت لام (۱۰۰۰) و فاکتور رقت ضرب می کنیم.
C=n × (رقت فاکتور ×سوسپانسیون حجم)/( V_( Total) )
V_( Total= ) شده شمارش های مربع تعداد × 〖۱۰〗^(-۴) ml

برای اطلاعات بیشتر در این زمینه به قسمت وبلاگ سایت مبحث تکنیک های رایج کست سلولی مراجعه فرمایید

فریز کردن:
هدف از فریز گرفتن سلول ها نگهداشتن آنها برای مدت طولانی است. زیرا در صورت پاساژ دادن سلول به دفعات زیاد، سلول پیر شده و شکل و حالت طبیعی خود را از دست می دهد.

مواد لازم:
کرایو ویال به تعداد لازم
DMSO 100uL
FBS به اندازه ساخت مایع سلولی ۱۰% سرم
مواد لازم جهت پاساژ
لام هموسیتومتر
روش کار:
محيط روي سلولها را خارج کرده و سلولها را با بافر PBS شستشومی دهیم.
حدود μl ۷۰۰ محلول Trypsin–EDTA روي سلولها ريخته و سلولها را از ته فلاكس جدا می کنیم.
روي سلولهاي كنده شده ml۳ محيط كشت DMEM ریخته و آن را داخل فالكونمی ریزیم.
سلولها با دور rpm ۱۰۰۰ به مدت ۱ دقيقه سانتريفيوژمی کنیم.
محلول رويي را ( كه شامل محيط سلولها و Trypsin–EDTA است ) از روي رسوب سلولها خارج كرده و محيط جديد DMEM كه حاوي ۱۰% سرم است را روي آنمی ریزیم.
سلولها با استفاده لام هموسایتومتر شمارش می کنیم.
محیط DMEM حاوی ۱۰% سرم که شامل حدود ٢ میلیون سلول است را برداشته و با سمپلر داخل کرایوویال (ویال های ml ٢ که دارای درهای محکمی می باشند و مخصوص فریز کردن سلولها است) میریزیم.
در لحظه آخر ترکیب ۱۰% DMSO را به کرایوویال ها اضافه کرده و به سرعت آنها را به مدت ۱ ساعت در ٢۰- قرار می دهیم.
بعد از گذشت این زمان به مدت ٢۴ ساعت کرایوویال ها را به فریزر ۷۰- انتقال میدهیم.
بعد از گذشت این زمان آنها را به تانک ازت انتقال داده می شود که در اینصورت به مدت چندین سال میتوان آنها را در تانک ازت نگهداری کنیم یا می توانیم برای مدت چندین ماه آنها را در فریزر ۷۰- نگهداری کرد.

ذوب کردن سلول (دفریز کردن):
وقتی به یک رده ی سلول نیاز داریم که فلاسکی از آن در انکوباتور نیست باید به تانک ازت مراجعه کرده و یک کرایوویال برداریم. کرایوویال را بلافاصله زیر هود برده با حرارت دست ذوب می کنیم. وقتی هنوز مقداری یخ در کرایوویال مانده محتویات را آرام آرام به داخل فالکون ۱۵ ای که قبلاً با ۶- ۷ میلی لیتر محیط کشت بدون سرم پرکرده ایم می ریزیم. این حرکت برای خنثی کردن DMSO می باشد. حال با دور ۱۰۰۰ در دقیقه و به مدت ۷ دقیقه سانتریفوژ می کنیم. محلول رویی را دور ریخته و به پلیت سلولی ۱ml محیط کشت دارای سرم اضافه کرده و به فلاسک T25 حاوی ۵ ml محیط کشت دارای سرم اضافه می کنیم. ۲۴ تا ۴۸ ساعت بعد (با توجه به نوع سلول و زمان لازم آن برای چسبیدن به کف فلاسک) محیط کشت را خارج و محیط جدیدی به آن اضافه می کنیم این کار مقدار جزئی از DMSO را که در فلاسک باقی مانده خارج می کند.

احتیاط های لازم در کار کشت
تمامی مراحل کشت سلولی باید در زیر هود انجام شود. در ابتدا باید تمام وسایل لازم را الکل زده و زیر هود می گذاریم سپس نور ماوراءبنفش را به مدت ۱۵ دقیقه روشن کرده تا وسائل کاملاً استریل شود. لازم به تذکر است که پس از اتمام نور UV به مدت ۲۰ دقیقه وارد اتاق کشت نشوید.
قبل و بعد از انجام کار زیر هود را با الکل ۷۰% شست و شو داده شود.
همواره در حین کار دستکش به دست داشته باشید قبل از بردن دست ها به زیر هود دستکش ها را با الکل ۷۰% شست و شو دهید.
هر ۲ هفته یکبار باید انکوباتور کاملاً تمیز شود. شست و شوی انکوباتور با الکل ۷۰% و قارچ کش الزامی است. سپس آب داخل انکوباتور باید تعویض گردد. به همراه آب در داخل انکوباتور سولفات مس هم باید ریخته شود.
باید توجه داشت که در انکوباتور نباید زیاد باز بماند تا حرارت و غلظت CO2 در انکوباتور تغییر نکند.
سعی شود دمپایی و روپوشی که در داخل اتاق کشت استفاده می شود از آن خارج نشود.
محصولات با منشا انسانی دارای پتانسیل خطر زیستی هستند. حتی برای نمونه های ثبت شده که دارای جواب منفی برای HIV و هپاتیت C هستند بایستی احتیاط های لازم و مناسب را برای جلو گیری از تماس سهوی در نظر گرفته و اعمال کرد.
لازم به ذکر است که باکتریی به نام مایکو پلاسما وجود دارد که زیر میکروسکوپ قابل رویت نیست و شکل طبیعی سلول را تغییر نمی دهد ولی در رشد سلول تاثیر منفی می گذارد،چنانچه بهداشت رعایت نشود به دلیل مستعد بودن سلول به ابتلا به این باکتری،سلول سریعا الوده میشود،از بین بردن این نوع باکتری بسیار دشوار و تقریبا نا ممکن است.

print
Tags: , , ,


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

10 + 20 =