مواد مورد نیاز در محیط کشت سلولی

محیط کشت سلول
محیط کشت سلول ماده ی پایه و ضروری برای انجام کارهای کشتی است. محیط کشت ، مواد غذایی لازم جهت رشد و بقای سلول را فراهم کرده و از طرفی نیازهایی از سلول که بر پایه خصوصیات فیزیوشیمیایی آن است از جمله اسمولاریته ـ pHو … را فراهم می کند. به طور کلی محیط های کشت سلولی دارای اسید آمینه های ضروری، نمک های آلی و غیرآلی، ویتامین ها، فلزات، قند، چربی و اسیدهای نوکلئیک هستند. مقدار و نوع مواد ذکر شده بستگی به نوع رده ی سلولی مورد استفاده دارد. از طرفی محیط کشت یک محیط پایدار از لحاظ اسیدی و بازی بودن برای سلول فراهم می کند تا آلودگی های مختلف نتواند جلوی رشد سلول را بگیرد.

مواد مورد نیاز برای ساخت محیط کشت
۱٫ پودر محیط کشت
بسته به نوع محیط کشت در حال ساخت پودرهای متعددی وجود دارد که از جمله می توان به DMEM و RPMI اشاره کرد. محیط کشت DMEM دارای آمینواسیدها، نمک هایی از جمله کلسیم کلراید و منیزیم سولفات، گلوگز و ویتامین هایی مثل ریپوفلاوین فولیک اسید و … است. محصولات نوری مثل پروکسیدهیدروژن که برای سلول کشنده است در این محیط کشت ها تولید می شود. ریبوفلاوین، تریپتوفان یا تیروزین مواد اساسی تولید کننده پراکسید در هنگام در معرض قرار گرفتن نور هستند.
محیط کشت RPMI از محیط کشت های مورد نیاز برای رشد سلول های لنفوئیدی انسانی هستند. این محیط کشت دارای مقدار قابل توجهی فسفات است که محیط سلول را برای قرارگیری در معرض co_2 %5 آماده می کند. RPMI دارای انواع مختلفی از جمله RPMI_1640 است که در این پژوهش از این نوع RPMI استفاده می شود. در RPMI_1640 از سیستم بافر بیکرنات استفاده می شود که با سایر محیط های کشت سلول های انسانی متفاوت است.
به بسیاری از پودرهای محیط کشت سلول ها برای نشانگر pH بودن ، فنول رد اضافه می شود. فنول رد رنگ محیط کشت را قرمز می کند. شدت رنگ بیانگر میزان pH محیط است. هرچه رنگ قرمز تر باشد محیط کشت اسیدی تر و هرچه رنگ نارنجی تر باشد محیط بازی تر است در هنگام ساخت محیط کشت باید به رنگ آن توجه کرد تا در صورت نیاز از بافرهای اسیدی و قلیایی برای متعادل کردن PH استفاده نمود.
۲٫ بافرهای آلی و غیرآلی:
تنظیم بودن pH محیط کشت یکی از مهم ترین فاکتورها در محیط برای رشد خوب سلول ها است. سلول ها در حین رشد، مواد اسیدی متابولیکی از خود تولید می کنند که محیط را مناسب برای رشد باکتری ها می نماید از این رو اضافه کردن بافرهای مناسب به محیط، برای حفظ و کنترل pH ضروری است.
یکی از بافرهای غیرآلی استفاده شده در محیط کشت ، بیکرنات سدیم است. این بافر ارزان بوده و معمولاً برای حفظ محدوده ی بافری از آن استفاده می شود. این بافر غیرآلی محیط سلول را در محدوده ی pH 1/5 تا ۱/۷ نگه می دارد. زمانی که به pH بالاتر نیاز داشته باشیم و یا بخواهیم pH محیط را ثابت نگه داریم از بافر الی HEPES استفاده می کنیم. HEPES یک بافر آلی دوقطبی است که معمولاً pH محیط را ثابت نگه می دارد. سیستم بافری HEPES محدوده ی pH را بین ۶/۷ – ۲/۷ نگه می دارد که نسبت به بیکرنات سدیم بهتر است. البته لازم به ذکر است که برخی سلول ها به HEPES حساس هستند بنابراین مقدارHEPES اضافه شده به محیط بسیار حائز اهمیت است.
۳٫ سرم جنین گاوی ( FBS)
استفاده کردن از مکمل های رشد در محیط کشت در فراهم کردن فاکتورهای رشد و هورمون ها، خنثی کردن مواد سمی، حفاظت کردن سلول از استرس های فیزیکی و از بین رفتن آن مؤثر است.
سرم جنین گاوی از لحاظ دارا بودن فاکتورهای مناسب رشدی بسیار غنی است که بین رشد و مرگ سلول تعادل ایجاد کند. منبع سرم جنین گاوی، پلاسمای خون می باشد. این مکمل به دلیل داشتن فاکتورهای رشدی بیشتر و ایمونوگلوبین های کمتر نسبت به سایر مکمل ها مثل سرم گاو، سرم اسب و … رایج تر و البته گران تر است. این مکمل غنی از هورمون های ضروری ، پروتئین ها و ویتامین های لازم جهت رشد بهتر سلول است. معمولاً FBS را با غلظت ۵ تا ۲۰ درصد به محیط کشت اضافه می کنند. اما غلظت رایج FBS در سرم %۱۰ است.
در حالت عادی باید قبل از اضافه کردن FBS به محیط آن را غیر فعال کرد. برای این کار ابتدا باید روز قبل از غیرفعال کردن ، آن را به یخچال منتقل کرد تا یخ آن آب شود. در صورت کامل آب نشدن آن در دمای اتاق به مدتی قرار می دهیم تا کاملاً باز شود. حال به مدت ۱۵ دقیقه در بن ماری با حرارت ۳۰’C قرار می دهیم برای یکنواخت پخش شدن دما هر ۱۰ دقیقه یکبار ظرف محتوی سرم را وارونه می کنیم. سپس به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۵۶’C قرار می دهیم. حال سرم را از بن ماری خارج کرده می گذاریم تا سرد شود سپس در زیر هود در مقدارهای مناسب در درون فالکون ۱۵ الیکات کرده ، دور آن را پارافیلم می زنیم و در فریزر نگهداری می کنیم.
۴٫ آنتی بیوتیک و قارچ کش:
درآزمایشگاه ها و در اتاق های کشت به دلیل رعایت نشدن کامل اصول بهداشتی و تعداد زیاد پژوهشگران، معمولاً محیط برای رشد باکتری ها مناسب است. بدین دلیل عموماً به محیط کشت ساخته شده، مقدار مشخصی آنتی بیوتیک پنسترپ که حاوی ۲آنتی بیوتیک پنی سیلین و استرپترمایسین است اضافه می شود. این ۲ آنتی بیوتیک برای از بین بردن باکتری های گرم مثبت و گرم منفی ، مهار تولید دیواره ی سلولی باکتری و مهار تولید پروتئین است. در فصول گرم سال به دلیل گرم و مرطوب بودن محیط داخلی انکوباتور و فضای اتاق کشت شرایط برای رشد قارچ ها فراهم می شود. به همین دلیل خوب است در فصول گرم به محیط کشت آنتی بیوتیک همراه با قارچ کش اضافه کنیم به این مکمل آنتی مایکوتیک گویند که حاوی آمفوتریسین B و پنسترپ است.

روش ساخت محیط کشت:
مواد لازم:
 آب مقطر ۲بار تقطیر شده (اتوکلاو شده) ml 1000
 پودر محیط کشت RPMI_1645 10.4g
 بی کرنات سدیم ۲g
 HEPES 2.5g
 ظرب درب دار تمیز (اتوکلاو شده) یک عدد
 فیلترسرسرنگی با قطر ۳۰ml ومنافذ ۲۲/۰ میکرومتر به تعداد لازم
 سرنگ ۲۰ml به تعداد لازم
 آنتی بیوتیک ۱ml به ازای هر ۱۰۰mlمحیط کشت

روش کار:
لازم به ذکر است مقادیر گفته شده برای ساخت ۱L محیط کشت است برای مقدار کمتر یا بیشتر با توجه به مقادیر باید نسبت بسته شود.
ابتدا ۱۰٫۴g پودر RPMI را در ا لیتر آب مقطر ریخته ، درون آن یک مگنت مغناطیسی قرار می دهیم. حال به مدت ۲ ساعت درون همزن مغناطیسی بهم می زنیم تا پودر کاملاً در آب حل شود. سپس بیکرنات و Hepes را اضافه می کنیم. (در صورت اضافه کردن HEPES دیگر نیازی به سنجش pH با pH متر نیست) حال به مدت نیم ساعت دوباره می گذاریم تا هم بخورد. وقتی محیط کاملاً شفاف و یکدست شد ، محیط کشت را زیر هود برده و با فیلتر سرسرنگی فیلتر می کنیم (باید دقت کنیم این کار را آرام انجام دهیم تا فیلتر سوراخ نشود. هر ۱۰۰ تا ۱۵۰ میلی لیتر هم که فیلتر کردیم فیلتر را تعویض نمائیم). پس از انجام عمل فیلتراسیون به محیط کشت ۱۰ml پنسترپ اضافه می کنیم. دور ظرف را محکم بسته در آن را پارافیلم می پیچیم و در یخچال نگه داری می کنیم.
این محیط کشت بدون سرم است. برای ساخت محیط کشت %۱۰ ،FBS هر بار مقدار معینی از محیط را با مقدار مشخصی FBS ترکیب کرده و به غلظت %۱۰ می رسانیم.

 تریپسین ـ EDTA :
از ترکیب تریپسین و EDTA برای کندن سلول ها از کف فلاسک استفاده می شود. سلول ها پس از رشد به فلاسک می چسبند. میزان چسبندگی سلول ها به کف فلاسک بستگی به نوع سلول دارد. EDTA با خنثی کردن یون Ca و Mg در افزایش دادن به فعالیت تریپسین بسیار تاثیرگذار است.
روش ساخت:
• تریپسین ۰٫۲۵g
• EDTA 0.01g
• PBS(1×) ۱۰۰ml
• ظرف درب دار (اتوکلاو شده) یک عدد
• ویال استریل به تعداد لازم
• پارافیلم به تعداد لازم
ترکیب همه ی مواد فوق باید زیرهود انجام شود. به ۱۰۰ml PBS مقدار۰٫۲۵ gr تریپسین و ۰٫۰۱g EDTA اضافه کرده و خوب هم زنیم تا محلول کاملاً شفاف شود. حال محلول را فیلتر کرده و در ویال های ۲ml ای الیکات کرده دور آن را پارافیلم پیچیده و در فریزر نگهداری می کنیم.

بافر PBS (Phosphate Buffered Saline)
بافر PBS ، بافری است که عموماً با گروه فسفات خود در حفظ PH محیط کمک می کند. اسمولاریته و تراکم یونی آن معمولاً مشابه بدن انسان است. این بافر شامل نمک های سدیم کلراید، پتاسیم کلراید ، سدیم فسفات و پتاسیم فسفات است. این بافر محیط را مشابه حالت in vivo می کند. از این بافر برای ساخت تریپسین ۰٫۲۵% ، شست و شوی سلول های مرده و … استفاده می شود.

print
Tags: , , , , ,


4 دیدگاه

  • Mahal1366 says:

    سلام
    میخواستم بدونم آیا گرم کردن pbs در بنماری قبل از شستشوی سلولها و محیط کشت، pbs رو خراب میکنه؟
    بعضیا میگن pbs رو همونطور که از یخچال خارج میکنی باید به سلول بزنی ولی به نظرم سرمای اون باعث شوک به سلول میشه

    • Ava Modirzadeh says:

      سلام. بله نظر شما کاملا درسته و سرد بودن مواد سبب شوک سلول ها و اسیب دیدن اونها میشه. پس باید حتما قبل از اضافه کردن محلول ها از جمله محیط کشت ، PBS و … به سلول اون ها رو کمی در بن ماری گرم کنیم

  • Leili says:

    احتمالا میزان انتی بیوتیک مصرفی اشتباه نیست؟

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

بیست − 16 =