سنتز cDNA از RNA های استخراج شده

بعد از اطمينان از سلامت هريك از نمونه هاي RNA روي ژل آگارز و سنجش غلظت آنها با دستگاه نانودراپ(Nano Drop)، مقدار ۱ مایکرو گرم از هريك از نمونه ها براي تهيه c DNA استفاده میشود.
تبدیل RNA به DNA تکنیکی است، که جهت تهیه cDNA که برای انجام RT-PCR صورت می پذیرد. الگوی اولیه در RT-PCR، مولکول RNA تک زنجیره ای است. اما مستقیما با RNA نمی توان PCR انجام داد. از آنجایی که DNA پلی مراز قادر به استفاده از RNA به عنوان الگو نمی باشد، مرحله دیگری به PCR اضافه شده است. طی این مرحله، با استفاده از آنزیم ریورس ترانسکریپتاز با منشاء ویروسی، از الگوی RNA، cDNA مکمل آن سنتز می شود و یک رشته پلی نوکلئوتیدی DNA از روی RNA ساخته می شود و بوسیله تکنیک PCR تکثیر می یابد. برای ساخت DNA، از آغازگر عمومی (پرایمر) استفاده می شود.

روش کار:
براي انجام واکنش Real-Time PCR نياز به DNA داريم براي همين DNA مکمل يا cDNAازRNA بايد ساخته شود. براي ساخت از rRNAوtRNA ازهگزامرهاي تصادفي استفاده مي¬شود ولي براي ساخت آن از mRNA از اليگو dT استفاده مي¬شود. اليگو dT به رشته الگو متصل مي¬شود و آنزيم ترانس¬کريپتاز معکوس cDNA را از روي رشته الگو مي¬سازد و در ادامه RNaseH رشته RNA الگو را تجزيه مي¬کند .
در هر واکنش ساختcDNA به µg 1 از RNA نياز است. براي به‌دست آوردن حجمي از نمونه RNA که حاوي µg 1 RNA باشد، بايد عدد ۱۰۰۰ را بر غلظتRNA اندازه گيري شده توسط نانودراپ (برحسب (ng/µl تقسيم کرد. عدد حاصل را λ مي¬ناميم. واحد λ، µl خواهد بود:
λ (µl) = 1000/ RNA غلظت (ng/µl)
حجم DEPS واتر مورد نياز از فرمول زير به‌دست مي¬آيد:
DEPS water (µl) =20- λ
جزئيات مراحل سنتز cDNA به شرح زير است:
ابتدا در یک ویال ۵/۰ میلی لیتر استریل و عاری از RNA مواد زیر اضافه شد:
• RNA کل با حجم محاسبه شده ( ۱g)
• پرایمر Oligo(dT)18 1l
• آب عاری از Nuclease تا حجم کل ۱۲l شود
۲) سپس ویال به دستگاه PCR منتفل گردید و ۵ دقیقه در دمایc65 قرار داده شد.
۳) سپس ویال حاوی مواد واکنش بلافاصله روی یخ گذاشته شد و ترکیبات زیر به ترتیب به آن اضافه شد( حجم کل ۲۰l ):
• Reaction buffer به اندازه( ۵X) 4l
• مخلوط dNTP ( 10mM)2l
• Riboloch به اندازه ۱l
• آنزیم RT Revert Aid به اندازه ۱l
۴) سپس ویال به دستگاه PCR منتقل گردید و ۱ ساعت در دمای c42 قرار گرفت.
۵) بعد از آن برای متوقف کردن واکنش، تیوب به مدت ۱۰ دقیقه در دمای c70 قرار گرفت.

cDNA سنتز شده در دمای c20 – نگهداری شد.

کیت های متعددی از جمله فرمناز، اینترون و سیناکلون برای سنتز c DNA وجود دارد که بسته به بودجه و کیفیت کار انتخاب میشوند.

دوستان اگر احساس می کنید به اطلاعات بیشتر و واضح تری در زمینه ی سنتز cDNA نیاز دارین به قسمت وبلاگ ، مبحث cDNA مراجعه فرمایید. امیدوارم بیشتر و بهتر بتونه کمکتون کنه….

print
Tags: ,


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

هشت + شش =