جداسازی سلول‌های بنیادی بافت چربی انسانی و تمایز آنها

مواد و وسایل مورد نیاز:
 تیغ جراحی استریل
 بطری و مگنت استریل شده
 دستگاه مینی استیرر
 فلاسک کشت سلول T25
 فالکون ۱۵ میلی لیتری و ۵۰ میلی لیتری
 استرینر(فیلتر)۱۰۰ میکرومتر
 بافر فسفات سالین (PBS) فاقد یون‌های منیزیم و کلسیم
 آنتی بیوتیک‌های پنی سیلین و استرپتومایسین
 کلاژناز تیپ A
 سرم جنین گاوی (FBS)
 محیط کشت (DMEM)

روش جداسازی سلول‌های بنیادی بافت چربی
بعد از جراحی و پس از بررسی سابقه ی بیماری و اخذ رضایت از بیمار، نمونه‌ها در ظروف شیشه ای استریل روی یخ قرار گرفته و به آزمایشگاه منتقل می شود. سپس در شرایط استریل زیر هود کشت سلولی، نمونه‌ها با PBS حاوی آنتی بیوتیک چندین بار شستشو داده شده و پس از جدا کردن بافت‌های زائد با استفاده از تیغ جراحی استریل تا حد امکان ریز می شود. سپس بافت خرد شده به درون یک بطری کوچک شیشه ای استریل حاوی مگنت و آنزیم کلاژناز ۲/۰ درصد منتقل شده و روی استیرر و در انکوباتور ۳۷ درجه ‌سانتی‌گراد قرارمیگیرد. به این ترتیب سلول‌ها در دمای ۳۷ درجه ‌سانتی‌گراد و به مدت ۱۵-۲۰ دقیقه ‌جداسازی می شوند. پس از متلاشی شدن بافت چربی، کلاژناز حاوی سلول‌ها به لوله‌های سانتریفیوژ ۱۵ یا ۵۰ میلی لیتری منتقل شده و توسط محیط DMEM با FBS %10 رقیق می گردد. سپس سوسپانسیون سلولی با دور rpm 1500 به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ شد تا کسر استرومایی-عروقی (SVF) به دست آید. رسوب سلولی حاصل در محیط DMEM تازه حاوی ۲۰ درصد سرم جنینی گاوی و ۱ درصد آنتی بیوتیک پنی سیلین و استرپتومایسین معلق و پس از عبور از فیلترهای ۱۰۰ میکرومتری به فلاسک‌های T25 منتقل شده و در انکوباتور ۳۷ درجه ‌سانتی‌گراد با ۵ درصد CO2 و ۹۵ درصد رطوبت قرار میگیرد. ۳ تا ۴ ساعت پس از کشت مشاهده شد که ADSCها به کف فلاسک چسبیده اند که این اتصال از ویژگی‌های سلول‌های بنیادی مزانشیمی است. در این زمان به منظور حذف سلول‌های خونی باقی مانده محیط کشت سلول‌ها با محیط تازه تعویض شد. سلول‌ها پس از رسیدن به تراکم ۸۰-۹۰ درصد پاساژ داده شدند.

 تمایز سلول‌های بنیادی بافت چربی به استخوان
سلول‌های بنیادی بافت چربی در مرحله پاساژ ۴ برای القای تمایز به استخوان مورد استفاده قرار گرفتند. به این منظور، سلول‌های تیمار شده با فاکتور RG-108 به درون ظروف کشت مورد نظر به میزان per/mL 125000 منتقل و به مدت ۲۴-۴۸ ساعت در محیط DMEM حاوی ۲۰ درصدFBS کشت داده شدند. سپس، محیط سلول‌ها با محیط کشت تمایزی را که از بن یاخته خریداری شده بود جایگزین شد. سلول‌ها به مدت ۳ هفته در معرض محیط تمایزی قرار گرفتند و در این مدت یک روز در میان محیط سلول‌ها تعویض ‌شد. پس از گذشت ۳ هفته، محیط تمایزی به طور کامل کشیده و سلول‌ها با PBS شسته شدند. سلول‌ها با فرمالین ۱۰ درصد به مدت ۳۰ دقیقه ثابت شدند. سپس سلول‌ها با آب مقطر شسته شدند. ۴۵ دقیقه پلیت‌ها را در دمای اتاق نگه داشته و آب مقطر کامل کشیده شده ودر یک محیط تاریک Alizamin را اضافه کردیم.مجددا پس از چهار بارشستشو با آب مقطر و با شسته شدن کف پلیت از Alizamin ، PBSرا اضافه کرده در نهایت سلول‌های تمایز یافته به استخوان را می‌توان با میکروسکوپ مشاهده نمود.

 تمایز سلول‌های بنیادی به سلول‌های چربی
سلول‌های بنیادی بافت چربی در مرحله پاساژ ۴ برای القای تمایز به سلول‌های چربی مورد استفاده قرار گرفتند. به این منظور، سلول‌های تیمار شده با فاکتور RG-108 به درون ظروف کشت مورد نظربه میزان ۱۲۵۰۰۰ per/mL منتقل شدند به مدت ۲۴-۴۸ ساعت در محیط DMEM حاوی ۲۰ درصد FBS کشت داده شدند. سپس، محیط سلول‌ها با محیط کشت تمایزی چربی که از بن یاخته خریداریجایگزین شد و سلول‌ها به مدت ۳ هفته در معرض محیط تمایزی قرار گرفتند. در این مدت محیط یک روز در میان تعویض شد. بعد از گذشت ۳ هفته، محیط تمایزی به طور کامل کشیده و سلول‌ها با PBS شسته و با پارافرمالدیید ۴% به مدت ۱۰ دقیقه در یخچال ثابت شدند. سپس سلول‌ها با آب مقطر شسته شدند. ابتدا ایزوپروپانول ۶۰ درصد به سلول‌ها اضافه شد. بعد از گذشت ۵ دقیقه، ایزوپروپانول خارج و محلولOil RedO به ظرف کشت اضافه شد. پس از ۵ دقیقه، سلول‌ها با آب استریل شسته شدند. در انتها محلول هماتوکسیلین (۱ دقیقه) به سلول‌ها اضافه شد و پس از خالی کردن آن، ظروف سلول‌ها با آب شسته شدند.

print
Tags: , , ,


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

20 + یازده =