وسترن بلات

وسترن بلات یکی از روش های پر کاربرد در جداسازی و شناسایی پروتئین های خاص از مخلوط پروتئین های موجود در محیط سلولی ماست.. پس در کار سلولی برای اینکه پروتئین موردنظرمون رو شناسایی کنیم می تونیم از روش وسترن بلات استفاده کنیم…

چطوری؟؟؟ الان میگیم… در این تکنیک ابتدا پروتئین ها بر اساس وزن مولکولی از طریق run شدن روی ژل الکتروفورز از هم جدا میشن..بعدش ژلی که پروتئین ها روی اون run شدن به غشای نیتروسلولزی منتقل میشه در اینجا روی غشا برای هر پروتئین یک باند بر روی ژل ایجاد میشه…حالا این غشای نیتروسلولزی با انتی بادی های مربوط به پروتئین مورد نظر انکوبه میشه و در نهایت توسط دستگاه با نوری که از خودش ساطع میکنه پروتئین ما شناسایی میشه…

جالب بود نه؟؟؟ اما این یه تعریف کلی بود الان وقتشه که تک تک مراحل رو جداگانه با هم بررسی کنیم…

همون طور گفتیم در این تکنیک پروتئین های موجود در محیط سلولی شناسایی میشن پس مرحله ی اول مرحله ی لیز سلول و استخراج پروتئین هاست…
این مرحله در دمای پایین با کمک مهار کننده های پروتئازی انجام میشه… اگر هم از بافت استفاده میکنین باید قبلش با استفاده از روش های مکانیکی مثل هموژنایزر یا سونیکاسیون بافت را کاملا خرد کنین..
بعد از استخراج پروتئین ها بهتره که میزات غلظت پروتئین های استخراج شده تون رو بسنجین. اینکار بهتون اطمینان میده که نمونه هاتون با یک پایه ی یکسانی با هم مقایسه میشن… اصولا برای تعیین غلظت پروتئین ها از دستگاه اسپکتروفتومتر استفاده میکنیم..
با تعیین غلظت پروتئین ها این امکان به ما داده میشه تا مقادیر پروتئینی که در هر چاهک لود میکنیم رو بر اساس ارتباط بین غلظتش، مقدارش و حجمش بسنجیم…

بعد از سنجش غلظت پروتئین ها حجم مشخصی از پروتئین را با loading buffer که درون ان رنگ بروموفنول بلو وجود داره رقیق میکنیم این کار سبب شناور شدن هر چه بهتر نمونه پروتئینی در چاهک ها میشه.. رنگ هم سبب مشخص شدن پروتئین ها موقع run شدن در ژل میشه…
حالا حواستون باشه در این مرحله یعنی بعد از رقیق سازی مخلوط رو حرارت بدین تا ساختار های بزرگ دناتوره بشن اینکار باعث میشه تا مطمئن بشیم بار منفی امینو اسید های ما خنثی نشده و راحت میتونه به سمت قطب مثبت در دستگاه الکتروفورز حرکت کنه…

یک نکته مهم در انجام وسترن بلات داشتن کنترل های مثبت و منفیه…
برای کنترل مثبت بهتره از پروتئین هدفتون که خالص هست استفاده کنین تا صد در صد جواب بده تا مطمئن بشین اگر در نمونه تون باندی ندیدین ایراد از کارتون نبوده…
برای کنترل منفی هم بهتره از یک پروتئی دیگه مثل beta-actin استفاده کنین تا مطمئن بشین که اتصالات انتی زن انتی بادیتون غیر اختصاصی نبوده…
راستی حواستون باشه اینجا هم مثل الکتروفورز کردن RNA که دیروز صحبتش رو کردیم نیاز به یک مارکر های وزن مولکولی داریم که بهمون کمک میکنن تا وزن مولکولی پروتئین های جدا شده رو بفهمیم. ایم مارکر ها از انواع متنوعی از پروتئین ها با وزن های مولکولی متعدد تشکیل شدن. بهتره در چاهک اولمون مارکر رو اضافه کنیم.

حالا که پروتئین هامون استخراج شدن و تعیین غلظتشون کردیم و با loading buffer هم رقیق شدن میریم سراغ مرحله ی بعد…
این مرحله ، مرحله ی الکتروفورزه… برای انجام الکتروفورز نیاز به دو مدل ژل داریم..
ژل بالایی stacking gel نام داره که درصد غلظت اکریل امیدش کمه و ph اون معادل ۶٫۸ هستش . این ژل پرمنفذه و پروتئین ها روی اون به سختی از هم جدا میشن اما این حالت به پروتئین ها کمک میکنه تا باند هایی با شکل باریک و واضح sharp پیدا کنند…

ژل پایینی seperating gel یا Resolving gel نام داره.در این ژل غلظت اکریل امید بالاتره و PH ان در حدود ۸٫۸ هستش. غلظت بالای اکریل امید سبب ایجاد حفره های کوچکتر در ژل شده که کمک میکنه تا پروتئین ها بر اساس اندازه و سایزی که دارند سرع تر یا کند تر حرکت کنند و از هم جدا شوند..
وقتی ژل ها زو جاساز کردین در مخزن running buffer تون رو میریزین و دستگاه رو روشن میکنین..
ولتاژ خیلی مهمه ولناژ بالا سبب گرم شدن ژل و بهم ریختگی باند ها میشه…
ولتاژ بهینه در اکثر مقالات برای stacking gel در حدود ۸۰V و برای separating gel در حدود ۱۰۰V گزارش شده.
وقتی رنگ بروموفنول بلو به انتهای ژل رسید دستگاه را خاموش کنید و ژل را به ارامی در بیارین..

نمونه ی run شدن پروتئین ها در stacking gel

[ Photo ] نمونه ی run شدن پروتئین ها در stacking gel

نمونه ی run شدن نمونه ها در seperating gel

دقت کنین وقتی دستگاه رو خاموش کنین که نمونه ها به انتهای ژل رسیده باشند.

[ Photo ] نمونه ی run شدن نمونه ها در seperating gel

درصد های پیشنهادی اکریل امید بر اساس سایز پروتئین ها. “توجه کنین که هر چه درصد اکریل امید بالاتر بره اندازه ی حفره های داخل ان کوچکتر شده و پروتئین های کوچکتری رو از هم جدا میکنه”

درصد های پیشنهادی اکریل امید بر اساس سایز پروتئین ها

شمایی از عملکرد SDS-PAGE با دو ژل stacking در بالا و seperating در پایین

شمایی از عملکرد SDS-PAGE با دو ژل stacking در بالا و seperating در پایین

نحوه ی ساخت ژل ها

نحوه ی ساخت ژل ها

خوب خسته که نشدین؟؟؟ تا اینجا رو خوب متوجه شدین؟؟ خدا رو شکر..
پس پیش به سوی مرحله ی بعدی…
حالا قسمت stacking gel را جدا و دور ریخته میشه و برای مرحله ی بعدی از قسمت seperating gel با نام دیگر Resolving gel استفاده میکنیم.
مرحله ی بعدی مرحله ی انتقال باند ها از ژل به غشا است که بهش میگن blotting…
این مرحله با کمک ایجاد جریان الکتریکی بین ژل و غشا انجام میشه که برای این کار غشا بین ژل و الکترود کاتد حالت ساندویچ پیدا میکنه.. که این ساندویچ شامل دو تا sponge در دو انتها ، دو تا کاغذ فیلتر در دو سوی غشا و ژل هستش…
کاغذ فیلتر برای محافظت کردن از غشا و ژل گذاشته میشه…

نحوه ی قرار گرفتن ژل و غشا به حالت ساندویچ در وسترن بلات

نحوه ی قرار گرفتن ژل و غشا به حالت ساندویچ در وسترن بلات

در این مرحله به دو مسئله باید دقت کنین:
۱- ارتباط بین غشا و ژل باید تنگاتنگ باشد یعنی کاملا بهم چسبیده باشند تا مطمئن بشیم تصویر روی غشا شفاف و قابل فهم است…
۲- غشا باید بین ژل و قطب مثبت قرار داشته باشد این حالت سبب مهاجرت درست پروتئین های با بار منفی ها از ژل به غشا میشود.
به این مدل انتقال electrophoretic transfer می گویند که برای حالت های semi-dry و wet استفاده میشود.. این حالتی که ما الان داریم راجع بهش

حرف میزنیم حالت wet نام دارد و نسبت به حالت های دیگر رایج تر است و بیشتر برای پروتئین های بزرگ کاربرد دارد.

حالا بیاین یکمی راجع به انواغ غشاها صحبت کنیم…
در وسترن بلات ما دو مدل غشا داریم.غشای نیتروسلولزی (NC) و پلی وینیلیدین فلوراید (PVDF).

هر کدام از این دو مزایا و معایب خودشان را دارن. غشای نیتروسلولزی به دلیل میل ترکیبی بالای ان با پروتئین و قابلیت های نگهداری خیلی مورد توجه است اما میزان شکنندگی ان نیز بالاست و برای همین نمیتوان از ان برای reprobing دوباره استفاده کرد.

برخلاف غشای نیتروسلولزی PVDF در برابر اسیب های مکانیکی مقاوم تره و میشه ازش برای reprobing و ذخیره سازی استفاده کرد. اما به جاش نقطه ضعف ان ایجاد backgroud های بالاست برای همین شستشوی ان بسیار مهم است..

روش شستشوی PVDF: به مدت ۲تا۳ دقیقه در متانول غوطه ورش کنین. بعدش در transfer buffer خیلی سرد به مدت ۵ دقیقه انکوبه اش کنین. برای متعادل سازی ژلتون رو هم باید به مدت ۳ تا ۵ دقیقه در transfer buffer انکوبه کنین..
اگر این کارا رو نکنین غشا در حین انتقال چروک شده و باند ها خوبی نمیبینین…

حالا وقتشه که از من بپرسین بافر انتقال چیه و چرا ما باید ژل و PVDF رو درون اون بزاریم…
بافر PVDF از ۲۵mM محلول Tris-HCL به همراه ۱۹۲mM گلایسین و ۰٫۰۳% سدیم دو دسیل سولفات(SDS) و متانل درست میشه… متانل موجود در بافر سبب فیکس شدن پروتئین های روی سطح ژل و افزایش بار مثبت غشا میشود…

حالا میرسیم به چند تا نکته ی مهم در این مرحله که در درست انجام گرفتن ان خیلی دخیل است:
در این مرحله کاغذ های فیلتر و sponge باید در بافر انتقال خیس شوند. تمام مراحل درست کردن ساندویچ باید در ظرف محتوی بافر انتقال صورت بگیرد تا دائما ورق ها خیس باشند
باید دقت شود PVDF در همه ی مراحل خشک نشود از طرفی به هیچ عنوان ان را با دست لمس نکنید چون از حساسیت ان کاسته میشود.

دقت کنید در حین اضافه کردن هر ورقه از ساندویچ هیچ گونه حبابی بین صفحات ایجاد نشود پس باید دائما با کمک وسیله ای مثل پیپت پاستور حباب ها را از بین ببریم.
حواستون باشه در همه ی مراحل درست کردن ساندویچ تمام اجزا باید در بافر انتقال باشند تا مرطوب بمانند.

خوب حالا ساندویچی که درست کردین رو به دستگاه انتقال (تانک مخصوص انجام وسترن بلات) منتقل کنین.. درون تانک بافر انتقال بریزین و حواستون باشه که ساندویچ باید کاملا با بافر پوشیده بشه… در حین پروسه ی انتقال تانک را در زیر یخ یا در اتاقی با دمای ۴ درجه نگهداری کنین. حالا دستگاه و روشن کنین و اجازه بدین عمل انتقال به مدت ۱/۵ ساعت با ولتاژ ۱۵-۲۰ ولت انجام بشه…

نمایی از غشا بعد از انتقال

نمایی از غشا بعد از انتقال

خوب ما تا اینجا با هم پروتئین های سلولیمون رو استخراج کردیم، بعدش غلظت مخلوط پروتئینی نمونه هامون رو با دستگاه اسپکتروفتومتر سنجیدیم و بعد با کمک الکتروفورز پروتئین ها رو بر اساس وزن مولکولیشون روی ژل از هم جدا کردیم و سپس در تانک وسترن بلات به کمک جریان الکتریکی پروتئین ها رو از ژل به غشا منتقل کردیم…

حالا نوبت مرحله ی شستشو و blocking هستش…

اولش بگم قبل از مرحله ی blocking یک مرحله پیشنهادی وجود داره که مطمئن بشیم پروتئین ها به غشا منتقل شدن… برای این اطمینان باید غشا رو با رنگ ponceau red رنگ امیزی کنیم. به این صورت که غشا را به مدت ۵ دقیقه در ظرف حاوی رنگ قرار میدیم. بعدش با اب بشورین تا باند ها معلوم بشن…
اما حواستون باشه تا بعد از دیدن باند ها خوب غشا رو با TBS-tween بشورین تا رنگ کاملا از بین بره و گرنه باعث ایجاد خطا در کارتون میشه..
اگر دارین با غشای PVDF کار می کنین برای دوباره فعال شدن عملکرد واکنشی غشا باید غشا رو اول با متانول و بعد با TBS-tween خوب بشورین…

حالا رسیدیم به یکی از مهمترین مراحل وسترن بلات که خیلی ها اون رو درست انجام نمیدن… و اون هم مرحله ی blocking هست…
اصلا این مرحله چیه که انقدر مهمه؟؟؟
همونطور که میدونین مرحله ی تعیین کننده ی وسترن بلات مرحله ی اتصال انتی بادی مخصوص پروتئین مورد نظر ما به انتی ژن پروتئین ماست پس هر گونه اتصال غیر اختصاصی انتی بادی ها با انتی ژن میتونه در کار ما خطا ایجاد کنه برای همین ما در مرحله ی blocking میایم تمام فضاهای غیر اختصاصی در غشا رو که توسط پروتئین ها اشغال نشدن مسدود میکنیم…

نمایی از عملکرد blocking regent ها

نمایی از عملکرد blocking regent ه

خوب الان باید reagent های رایج برای مسدود کردن غشا رو بشناسیم…
مواد مختلفی برای این کار وجود داره اما اینکه کدومش رو انتخاب کنین بستگی به پروتئین مورد نظر شما و انتی بادی مورد استفاده تون داره…
از رایج ترین پروتئین هایی که برای مسدود کردن غشا استفاده میشن BSA و شیر بدون چربی(Non-fat milk) هستن…
اتصالات هر انتی ژن-انتی بادی ویژگی های خاص خودش رو داره برای همین یکی از نکات طلایی در موفقیت وسترن بلات انتخاب پروتئین مسدود کننده ی درسته…

شیر بدون چربی نسبت به سایر مسدود کننده ها ارزون تر و در دسترس تره اما محدودیت هایی داره و با برخی از نشانگر ها سازگاری نداره.. چون در داخل اون کازئین وجود داره که در درونش فسفوپروتئین و بیوتین هست نمیتونیم ازش در کنار انتی بادی های Phosphor specific استفاده کنین چون در کارمون خطا ایجاد می کنه…
در این حالت باید از BSA استفاده کنیم

خوب رسیدیم به مراحل انتهایی که اضافه کردن انتی بادی ها به غشا برای شناسایی پروتئین مورد نظر ماست…
در این مرحله ابتدا انتی بادی اولیه رو اضافه میکنیم… این مرحله بسیار شبیه به تکنیک ELISA است. می تونیم بسته به کارمون از انتی بادی های مونوکلونال یا پلیکلونال استفاده کنیم…
در انتخاب انتی بادی باید به دو نکته دقت کنیم…۱- انتی بادی ما باید قادر به شناسایی پروتئین های دناتوره باشد… ۲- باید قادر به ایجاد cross-reaction باشد تا بتواند به انتی بادی ثانویه متصل شود.

انتی بادی های پلی کلونال حساسیت بالاتری دارند اما نسبت به انتی بادی های مونوکلونال اختصاصیتشون کمتره…
حواستون باشه که برای انتخاب اتی بادی از گونه ای دور تر از گونه ی خودتون استفاده کنین..مثلا برای شناسایی پروتئین های موشی بهتره ار انتی بادی خرگوشی استفاده کنین به جای رت…

الان باید انتی بادی اولیه تون رو با بافر مسدود کننده اون رقیق کنین… بعدش در دمای ۴ درجه به مدت یک overnight در شیکر بذارین بمونه…حواستون باشه که در تمام مدت انکوباسیون باید شیکر حرکت کنه تا مخلوط انتی بادی و بافر به میزان یکسانی به همه جای غشا برسه…

روز بعدش غشا رو از محلول خارج کنین و محلول رو دور بریزین.. غشا رو هم به مدت ۵ دقیقه با بافر TBS-tween همراه با تکان های شدید ۵ بار بشورین.این مرحله خیلی مهمه چون سبب حذف اتصالات غیر اختصاصی از روی غشا میشه…
البته اگر خیلی هم زیاد بشورین ممکنه شدت سیگنالی که بهتون میده کم بشه.

غشا همراه با بافر و انتی بادی باید تمام مدت انکوباسیون در شیکر در حال چرخش باشه…

غشا همراه با بافر و انتی بادی باید تمام مدت انکوباسیون در شیکر در حال چرخش باشه...

حالا نوبت به استفاده از انتی بادی های ثانویه میرسه… حواستون باشه موقع انتخاب انتی بادی ثانویه حتما گونه اش بایدمتفاوت از گونه ای باشه که انتی بادی اولیه تون هست… مثلا اگر انتی بادی اولیتون یکی از ایزوتوپ های IgG باشه که در بز تولید شده انتی بادی ثانویه تون باید anti-goat IgG antibody باشه که در گونه ی دیگری تولید شده…
این مدل انتخاب سبب کاهش میزان background در غشا میشه..

مراحل اماده سازی انتی بادی ثانویه مشابه انتی بادی اولیه است. در اینجا هم باید انتی بادی رو با محلول مسدود کننده رقیق کنین و بعد به مدت بک ساعتدر دمای اتاق در شیکر همراه با بافر انکوبه کنید. بعدش بافر رو دور بریزین و مجددا ۵ بار به مدت ۵ دقیقه با بافر TBS-tween بشورین تا اتصالات غیر اختصاصی از بین بره ….

حالا نوبت به مرحله ی detection رسیده…

برای شناسایی و مشخص شدن لکه ها روش های بسیار متنوعی بر مبنای chemiluminescence ، chemifluorescence، fluorescence، chromogenic و یا radioisotopic وجود داره…
از رایج ترین روش های شناسایی روش electrochemiluminescence (ECL) هستش که هم ارزان تر و هم حساس تره. در این روش انزیم horseradish peroxidase (HRP) متصل به انتی بادی ثانویه طی واکنش اکسیداسیون سبب کاتالیز کردن واکنش ECL شده و از خود نور ساطع میکند.
حال این نور ایجاد شده توسط دستگاه جمع اوری شده و در اتاق تاریک بر روی فیلم پرینت می گردد.

در این مرحله از مخلوط ECL reagent نوع Aو B که حاوی سوبسترای HRP یعنی لومینول می باشد نیز استفاده می کنیم…این دو را با نسبت ۱:۱ با هم مخلوط میکنیم و بعد به مدت ۳ تا ۵ دقیقه غشا را بدون هیچ فشار یا اسیبی در درون ان قرار می دهیم. بعد از این مدت غشا را در اتاق تاریک توسط دستگاه روی فیلم عکسبرداری میکنیم.
بعد از خارج کردن غشا اطراف ان را به ارامی با دستمال پاک می کنیم و ان را در یک کاور پلاستیکی تمیز نگه میداریم.

لازم به ذکر است در برخی ازمایشگاه ها از روش( colorimetric(chromogenic استفاده میکنن که در اون سوبسترای انزیم HRP ماده ای مثل دی امینوبنزیدین (DAB) که یک ماده ی کروموژن است می باشد. در این حالت، از واکنش بین این دو رسوب قهوه ای رنگی روی غشا ایجاد میشود که محل پروتئین مورد نظر ماست…
از خوبی های این روش این است که نیازی به فیلم X-ray و مانند این ها ندارد اما بدی ان این است که برای میزان بالای پروتئین قابلیت شناسایی دارد که از این نظر نسبت به chemiluminescence کمتر مورد توجه قرار می گیرد.

خوب واقعا خسته نباشین… تک تک مراحل انجام وسترن بلات رو با هم بررسی کردیم…
امیدوارم که خوب هر مرحله رو متوجه شده باشین اما در صورت داشتن هر گونه سوال ازم بپرسین…
حالا میرسیم به قسمتی که خیلی از شما عزیزان از من درخواست کرده بودین تا راجع بهش باهاتون صحبت کنم… اون هم بررسی انواع خطاها و troubleshooting های این تکنیکه…
الان با هم مرحله به مرحله انواع خطاها و راه حل هاشون رو بررسی میکنیم.

اولین خطایی که با هم بررسی میکنیم دیدن باند های غیر طبیعی و ناخواسته است..
از دلایل ایجاد باند ناخواسته در محل اشتباه می تواند دگرده شدن به واسطه ی عمل پروتئاز ها باشد که راه حل ان استفاده از نمونه های تازه روی یخ و با عوض کردن انتی بادی می باشد
بعضی وقتا باند بالاتر از اونجاییکه ما انتظار داریم قرار میگیرد که در این صورت یعنی ساختار چهارم پروتئین ما دناتوره و شکسته نشده است که راه حل ان دوباره حرارت دادن مخلوط پروتئینی برای شکستن ساختار چهارم می باشد..

بعضی وقتا باند ها صاف و اصطلاحا flat نیستن که در این حالت دلیلش بالا بودن ولتاژ و run شدن سریع نمونه ها در ژل است پس باید ولتاژ را درست تنظیم کنیم از سوی دیگه باید دقت کنیم درصد ژلمون با نوع و سایز پروتئین های نمونه مون همخوانی داشته باشه..

دومین خطایی که بررسی میکنیم ایجاد باند های تار و مبهم است…
یکی از دلایل ان می تواند بالا بودن ولتاژ هنگام انتقال نمونه ها از ژل به غشا باشد که در این حالت بین ورقه های ساندویچ حباب ایجاد میشود پس دقت کنید ولتاژ خیلی بالا نباشد. از طرفی بین ورقه های ساندیچتون فاصله و حباب ایجاد نشود.دراخر اگر باز هم این مشکل ادامه داشت running buffer تون رو عوض کنین.

بعضی وقتا هم روی فیلم باند سفید میبینیم که دلیلش پروتئین یا انتی بادی زیاد است پس در مقدار انتی بادی دقت کنین.

بعضی وقتا هم باند هامون رو به صورت اسمیر میبینیم… در این صورت یا مقدار زیادی پروتئین در هر چاهک لود کردیم ویا غلظت انتی بادی اولیه مون زیاده که باید کمش کنیم…

خطای رایج بعدی ندیدن باند است که میتواند دلایل متعددی داشته باشد.
۱- یکی از دلایل ان میتواندانتخاب انتی بادی اشتباه یا غلظت غلط انتی بادی باشد فرقی نمیکنه چه انتی بادی اولیه و چه ثانویه اگر غلظتش کم باشه شما روی ژل باند نمیبینین..
از طرفی دقت کنین که برخی انتی بادی ها برای کار وسترن مناسب نیستند پس قبلش کامل مطالعه داشته باشین.
۲- بعضی وقتا هم ایراد در غلظت پایین یا نبودن انتی ژنه که در این حالت بهتره از یک نمونه ی مطمئن از نظر انتی ژنیک برای تایید نمونه تون استفاده کنین.
۳-بعضی وقتا شستشوی طولانی مدت هم شدت سیگنال دهی را کاهش میدهد پس لطفا خیلی وسواس نداشته باشین
۴-گاهی هم ممکنه خطا از بافر هاتون باشه .دقت کنین همیشه بافر هاتون تمیز و بدون الودگی و contamination باشه . اینم بدونین که اگر بافر هاتون الوده به سدیم ازید باشه می تونه انزیم HRP تون رو غیر فعال کنه..
۵- یکی از دلایل خیلی رایج دیگه اشتباه در استفاده از مسدود کننده ی شیر بدون چربی در کنار انتی بادی های Phosphor specific هستش که در این حالت باید به جای ان از BSA 5% استفاده کنین.
بعضی وقتا هم شیر بدون چربی تمام اتنی ژن ها رو مسدود میکنه که در اینصورت یا مقدارش رو کم کنین یا از BSA استفاده کنین.
۶- در مصرف متانول هم دقت کنین استفاده ی زیاد از اون هم باعث رسوب پروتئین در ژل میشه و هم سبب شکنندگی ژل و عدم انتقال صحیح پروتئین های درشت میگردد. پس غلظت متانولتون رو بر اساس وزن مولکولی پروتئینتون انتخاب کنین.

دقت کنین ولتاژ غلط و ایجاد حباب بین ورقه ها ، قرار گرفتن نادرست ورقه ها در ساندویچ از دلایل رایج ندیدن بانده..
هرگز بدون دستکش و پنس به غشا دست نزنین ، هیچوقت غشا رو لمس نکنین. همیشه غشاتون رو خیس و مرطوب نگه دارین..
وقتی دستگاه رو برای انتقال روشن کردین چند دقیقه صبر کنین تا ببینین سرعت انتقال درست انجام میشه.
در انتخاب غشا با سایز مناسب با توجه به اندازه ی پروتئینتون دقت کنین..اصلا اجازه ندین ژل و غشا هنگام انتقال داغ بشن. از یخ یا اتاق سرد استفاده کنین..
زمان انتقالتون رو بر اساس اندازه ی پروتئینتون تنظیم کنین تا پروتئین های کوچک از غشا رد نشن.میتونین از دو تا غشا برای پروتئین های کوچک استفاده کنین.

خطای رایج بعدی دیدن background های زیاده که میتونه به دلایل زیر باشه 

یکی از دلایل رایج غلظت بالای انتی بادیتونه که به غشا متصل میشه
یک دلیل دیگه کهنه بودن بافر های مصرفیتونه.
دلیل رایج بعدی استفاده از blocking buffer غلطه… بازم میگم اگر Phosphor specific انتی بادی استفاده میکنین از شیر بدون چربی به عنوان مسدود کننده استفاده نکنین
همچنین اگر انتی بادی ثانویه تون از نوع anti-bovine, anti-goat, or anti-sheep هست از شیر بدون چربی یا BSA استفاده نکنین چون این انتی بادی ها تمام IgG ها گاوی که مسدود شدن شناسایی میکنن. به جاش از سرم ۵% میزبانی که انتی بادی ثانویه از اونه استفاده کنین.
یک دلیل بعدی نشستن کافی غشاست .دقت کنین اگر مرحله ی شستشو کوتاه باشه background زیاد ایجاد میشه و اگر طولانی باشه سیگنال ضعیف میشه. پس مرحله ی شستشو خیلییی مهمه.
خشک شدن غشا بعد از اضافه کردن انتی بادی هم دلیل دیگه است که باید حواستون بهش باشه.

و در نهایت اخرین خطایی که بررسی میکنیم ایجاد لکه های ناجور و تکه تکه است..
یکی از دلایل انتقال غلط از ژل به غشاست. اگر بین ژل و غشا حباب ایجاد شود ممکن است سبب ایجاد لکه های تیره تر در فیلم شود.
دلیل بعدی استفاده نکردن از شیکر هنگام انکوباسیون با انتی بادی است. حواستون باشه که این مرحله در ایجاد واکنش بین انتی ژن و انتی بادی ها خیلی مهمه…

دلیل دیگر اتصال انتی بادی ها به blocking agent هاست که در این صورت یا باید agentتون رو عوض کنین و یا ان را برای حذف الودگی ها قبل از مصرف فیلتر کنین.
دلیل بعدی تجمع انتی بادی های ثانویه است که برای رفع ان باید انها را سانتریفوژ و فیلتر کنیم تا اون هایی که بهم چسبیده اند از هم جدا یا حذف بشن.

خوب خدا رو شکر تموم شد… فکر نمیکنم دیگه هیچ خطای خاصی مونده باشه ولی اگر شما خطای دیگری در کارتون داشتین بهم بگین تا راه حلش رو براتون بزارم…

print
Tags: ,


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

19 − هجده =