راهکارهای رفع خطا در تکنیک ایمونوهیستوشیمی (Immunohistochemistry Troubleshooting)

در این صفحه ما قصد داریم تمام راهکار های بروز خطا در کار ایمونوهیستوشیمی رو با ذکر دلیل بررسی کنیم و سپس برای هر خطا راهکارهای کارامد ارائه بدیم.

ما troubleshooting ها رو به ۴ دسته تقسیم میکنیم و هرکدام را جداگانه مورد بررسی قرار میدهیم.
۱- حالتی که اصلا باند نمیبینین.
۲- حالتی که لکه های غیر اختصاصی میبینین.
۳- حالتی که در اسلایدتون background بالایی دارین.
۴- حالتی که نمونه ی بافتیتون حل شده و با مرفولوژی خودش رو از دست داده…
فکر نمیکنم مشکلاتی که در این تکنیک باهاش مواجه هستین از این ۴ گروه خارج باشه.. پس اگر به راهکارهای من برای رفع هرکدومشون دقت کنین مشکلتون در این تکنیک برای جواب گیری کاملا حل میشه..

اولین حالتی که  قصد داریم با هم بررسیش کنیم ایجاد لکه های غیر اختصاصی در نمونه تونه…یک چیزی شبیه به شکل زیر…

لکه های غیر اختصاصی در نمونه

دلایل ایجاد لکه های غیر اختصاصی و راهکار های رفع ان:
۱- یکی از دلایل میتونه غلظت بالای انتی بادی های اولیه و یا ثانویه تون باشه..
برای رفع اون میتونین غلظت انتی بادی ها تون رو کم کنین و یا زمان انکوباشیون نمونه با انتی بادی ها رو کمتر کنین…

۲- یک دلیل دیگه فراموش کردن مرحله ی blocking هستش و یا اینکه این مرحله رو درست انجام نداده باشین…
راه حلش set up کردن مرحله ی blocking در ازمایشتونه.. یادتون باشه اصلا اصلا اصلا این مرحله رو دستکم نگیرین .. برای بلاک کردن انزیم peroxidase درونی از ۳%H2O2 و برای بلاک کردن انزیم فسفاتاز از ۲mM Levanisol استفاده کنین.

۳- دلیل مهم بعدی میتونه این باشه که اشتباها انتی بادی اولیه و نمونه ی اصلیتون از یک گونه بوده باشه…
یادتونه بهتون گفتم اگر گونه ی انتی بادی اولیه و نمونه تون یکی باشه مثلا هر دو موشی باشه باعث میشه انتی بادی ثانویه تون به همه ی انتی ژن های موجود در بافت هم متصل بشه که سبب ایجاد لکه های غیر اختصاصی میشه..پس حتما سعی کنین گونه ی انتی بادی اولیه تون با بافت مورد ازمایشتون متفاوت باشه…

۴- دلیل بعدی میتونه این باشه که سرم بلاک کننده تون درست عمل نکرده باشه… یادتونه گفتم با استفاده از سرم حیوانات مختلف که اجتماع عظیمی از انتی بادی ها رو داره میتونین انتی ژن های غیر اختصاصیتون رو بلاک کنین؟؟؟ ممکنه اون سرمی که استفاده کردین خوب عمل نککرده باشه و یا مقدارش کافی نبوده باشه…
راه حل عوض کردن سرمی هست که دارین ازش استفاده میکنین.. سرم های بوط به اسب، بز و خر قابلیت تعویض با هم رو دارن و انتی ژن های غیر اختصاصی بسیاری رو پوشش میدن..

۵- دلیل رایج بعدی خشک شدن اسلایدتون در حین کاره…
حواستون باشه که دائما باید اسلاید رو در محیط ها و مخزن های مرطوب نگه دارین و به هیچ عنوان اجازه ندین که هیچ نقطه ای از اسلاید حاوی بافتتون خشک بشه..

۶-و اخرین دلیل میتونه ایجاد لکه های بزرگ و تیره به اصطلاح Burn/Hot spots روی بافتتون باشه..
حتما اگر همچین لکه هایی دیدین انتی بادی هاتون رو با دور ۱۲۰۰۰g به مدت ۵ دقیقه سانترفیوژ کنین تا رسوبات انتی بادی تهنشین بشه.. مایع رویی رو بردارین و از اون استفاده کنین..

دومین خطایی که بررسی میکنیم ندیدن لکه بر روی نمونه و راه های رفع ان است.

به شکل زیر خوب دقت کنین..در شکل سمت چپ نمونه رنگ نگرفته است… برای همین شما لکه های قهوه ای که در نمونه ی سمت راست میبینین رو در شکل سمت چپ نمیبینین… بنظرتون چرا اینطوری شده؟؟؟

ندیدن لکه بر روی نمونه

بررسی دلایل رنگ نگرفتن بافت نمونه:
۱- اولین و ساده ترین دلیل اینه که شما یادتون رفته انتی بادی های اولیه و ثانویه تون رو اضافه کنین
دقت توی کار ازمایشگاهی خیلی مهمه.. اصلا نباید گیج بشین همیشه پروتکل کار رو داشته باشین و هر مرحله رو که انجام دادین از روی پروتکل خط بزنین…

۲- دلیل بعدی میتونه رقیق بودن بیش از حد انتی بادیتون باشه…
اگر انتی بادیتون رو خیلی رقیق کردین باید مقدار بیشتری انتی بادی به بافتتون بزنین و یا مدت انکوباسیون رو افزایش بدین ( مثلا به مدت یک overnight در ۴ درجه بافت رو با انتی بادی انکوبه کنین)
اگر با این راه باز هم لکه ای ندیدین مجبورین دوباره انتی بادیتون رو تیتر کنین.

۳- دلیل هم بعدی میتونه سازگار نبودن انتی بادی اولیه و انتی بادی ثانویه تون با هم باشه..
برای بار هزارم تاکید میکنم که حتما حتما دقت کنین انتی بادی اولیه و پانویه تون از یک گونه مشترک نباشن.. مثلا اگر انتی بادی اولیه تون موشیه انتی بادی ثانویه ای که استفاده میکنین anti-mouse secondary antibody گرفته شده از یک گونه ی دیگر استفاده کنین.

۴- دلیل رایج بعدی جدا شدن اتصال انتی بادی از انتی ژن هدفتون هست..
این اتفاق ممکنه به دلیل زیاد شستن بافت نمونه بعد از مرحله ی انکوباسیون با انتی بادی باشه. برای همین باید حتما روش شست وشو تون رو optimize کنین..
میتونین غلظت wash buffer ای که استفاده میکنین رو کم کنین.
میتونین از انتی بادی هایی که affinity بالاتری نسبت به انتی ژن هدفتون دارن استفاده کنین.

۵- ممکنه انتی بادی ای که استفاده میکنین مناسب تکنیک ایمونوهیستوشیمی نباشه..
حواستون باشه بعضی اوقات انتی بادی های وسترن با ایمونوهیستوشیمی متفاوته ( دلیلش رو قبلا گفتم) برای همین همیشه نمیتونین از انتی بادی های این دو تکنیک برای هم استفاده کنین.
حتما قبل از استفاده از انتی بادی datasheet رو بخونین..
گاهی وقتا حتی انتی بادی ای که استفاده میکنین بر اساس نوع روش فیکس کردن بافت هم با هم فرق میکنه. پس حتما قبل از استفاده از انتی بادی اطلاعات کامل ازش داشته باشین.

۶- دلیل بعدی میتونه این باشه که اصلا پروتئین هدف در بافت شما وجود نداره..
برای مطمئن شدن از این موضوع همونطور که قبلا هم گفتم باید از کنترل مثبت استفاده کنین ( یعنی در کنار کارتون حتما بافتی داشته باشین که مطمئنین ۱۰۰% پروتئین هدف شما رو داره اینطوری میتونین مطمئن بشین که پروتکل رو درست set up کردین یا نه..

۷- ممکنه در مرحله ی اماده سازی سوبسترای کروموژن استباه کرده باشین..
دوباره مرحله ی اماده کردن محلول سوبستراتون رو set up کنین.
حواستون باشه اگر مقدار DAB از یک حدی زیاد تر باشه ممکنه سیگنال رو کاهش بده.

۸- ممکنه یادتون رفته باشه که انتی بادی ثانویه تون رو در تاریکی نگهداری کنین ( این اتفاق در حالتی ممکنه رخ بده که شما از نشانگر های فلورسانس استفاده میکنین)
حتما در نگهداری از انتی بادی اولیه و ثانویه نهایت دقت را داشته باشین.. چون اگر مشکلی پیدا کنن امکان نداره بتونین از کارتون جواب درست رو بگیرین.

۹- ممکنه در مرحله ی دپارافینه کردن بافت اشتباهی مرتکب شده باشین ( مثلا خوب بافت رو از پارافین خالص نکرده باشین)
مرحله ی دپارافینه کردن بافت خیلی مهمه پس با دقت انجامش بدین.. زمان دپارافینه کردن رو افزایش بدین و حتما حتما از xylene تازه و fresh استفاده کنین.

۱۰- ممکنه در مرحله ی فیکس کردن بافت اپی توپ های اتصال به انتی بادی رو تغییر داده باشین!!!
اگر اینجوری شد حتما روش بازارایی انتی ژنیتون رو تغییر بدین تا اپی توپ هاتون اشکار بشن..
مدت زمان فیکس کردن بافت رو کاهش بدین.
ممکنه پروتئین هدف شما در هسته باشه ولی انتی بادیتون نتونه به داخل هسته نفوذ کنه…
برای رفع این مشکل باید یک ماده ی ایجاد نفوذ کننده مثل Triton X-100 رو به blocking buffer و بافر رقیق کننده ی انتی بادیتون اضافه کنین.

۱۱- یک دلیل دیگه ( که متاسفانه در ازمایشگاه های ایران خیلی رایجه) الوده بودن بافر PBS به باکتری است که سبب ایجاد اسیب به گروه های فسفات پروتئین هدفتون میشه..
برای رفع این مشکل باید به مخزت ذخیره ی بافر PBS تون ۰ .۰۱% ازید اضافه کنین.
اگر شرایطش رو دارین حتما از PBS تازه استفاده کنین.

۱۲- و در اخر ممکنه میزان پروتئین هدف در نمونه ی بافتیتون زیاد نباشه برای همین سیگنالی نمیبینین.
برای رفع این مشکل باید از مرحله amplification کردن سیگنال استفاده کنین.. مثلا انتی بادی های ثانویه ای که چند تا نشانگر رو با هم شناسایی میکنن استفاده کنین و یا اینکه از کیت های شناساگری که اختصاصیت بالایی دارن بهره بگیرین.

۱۳-راستی حواستون به مرحله ی باز ارایی انتی ژنی خیلی باشه.. هرگونه اشتباه در این مرحله از جمله زمان انکوباسیون نامناسب و یا استفاده غلط در بافر ها و تغییرات PH میتونه تاثیر بسزایی در ایجاد نشدن میانکنش های انتی ژن-انتی بادی و ندیدن لکه باشه…
حتما حتما این مرحله رو به دستی set up کنین… بر اساس نوع بافت و فیکس کردنتون از روش مناسبی برای بازارایی انتی ژنی استفاده کنین ( برای مطالعه بیشتر به قسمت بازارایی انتی ژنتی در تکنیک ایمونوهیستوشیمی مراجعه فرمایین).

سومین خطای مورد بررسی ایجاد background زیاد بر روی نمونه مون هست که باعث میشه نتونیم سیگنال های اصلی رو شناسایی کنیم..چرا اینجوری میشه؟؟برای رفعش باید چیکار کنیم؟؟

ایجاد background زیاد بر روی نمونه مون

۱- اولین و رایجترین دلیل غلظت بالای انتی بادی اولیه تون هست.
حتما سعی کنین قبل از شروع تکنیک تیتر مناسب انتی بادی تون رو پیدا کنین..
همونطور که قبلا هم گفتم انتی بادیتون رو باید با بافر رقیق کنین و بعدش به نمونه تون اضافه کنین.

۲- دلیل بعدی که متاسفانه خیلی ها بهش اهمیت نمیدن و برای همین جواب های درستی نمیگیرن اینه که انتی بادی ثانویه تون با انتی ژن های بافت نمونه تون واکنش بده!!!
بارها تکرار کردم که دوستان حواستون باشه که به هیچ عنوان انتی بادی ثانویه تون از گونه ی مشترک با بافت هدفتون نباشه چون اینکار باعث میانکنش بین انتی بادی ثانویه با انتی ژن های هدفتون میشه…
برای اطمینان از اینکه انتی بادی ثانویه تون با انتی ژن های هدفتون میانکنش نداره باید از یک کنترلی استفاده کنین که در اون انتی بادی اولیه اضافه نکردین..حالا اگر بعد از اضافه کردن انتی بادی ثانویه به نمونه تون سیگنالی دیدین یعنی انتی بادی ثانویه داره با انتی ژن های بافت میانکنش برقرار میکنه…
برای رفع اون میتونین انتی بادی ثانویه تون رو عوض کنین و از انتی بادی pre-absorb که تمام جایگاه های اتصالش با ایمونوگلوبین بافت هدف اشغال شده استفاده کنین ( برای درک بهتر به قسمت absorbtion control مراجعه کنین)

۳- دلیل بعدی میتونه اشکال در انجام مرحله ی blocking باشه.یعنی یا این مرحله رو فراموش کردین و یا درست انجام ندادین.
یادتون باشه که حتما بافتتون رو با سرم مخصوص به گونه ای که انتی بادی ثانویه رو ازش گرفتین block کنین.
زمان blocking تون افزایش بدین و یا اگر باز هم جوابتون خوب نبود بافر blocking تون رو عوض کنین.

۴- دلیل رایج بعدی خوب نشستن بافتتون هست…یعنی در مراحل شستشو دقت کافی رو نداشتین و سریع کار کردین.
در اینصورت میتونین یا مقدار Washing buffer تون رو زیاد کنین و یا مدت زمان شستشو رو در هر مرحله افزایش بدین.

۵- دلیل بعدی که خیلی ها نمیدونن خوب فیکس نشدن بافت نمونه تون هست.
حواستون باشه که حسابی به مرحله ی فیکس کردن نمونه مسلط باشین و اون رو درست انجام بدین.

۶- دلیل بعدی میتونه سیگنال دهی بیش از حد نشانگرتون باشه…
برای رفع این مشکل مدت زمان انکوباشیون با انتی بادی ثانویه تون رو کم کنین و یا انتی بادی ثانویه تون رو رقیق تر کنین.

۷- یک دلیل هم میتونه اضافه کردن میزان زیادی از سوبسترا (در اتصالات انزیمی) باشه..
یادتون نره که حتما سوبسترا رو قبل از اضافه کردن رقیقش کنین و اگر باز هم جواب خوب نبود مدت زمان انکوباسیون نمونه با سوبسترا رو کاهش بدین.

۸- اگر از نشانگر های فلورسنتی استفاده میکنین دلیل دیگر میتونه این باشه که مراحل فیکس کردن بافتتون باعث ایجاد autofluorescence شده باشه.
خیلیییی حواستون باشه که فیکس کردن بافت با فرمالین باعث ایجاد سیگنالی در رنج سبز میشه ( autofluorescence ) پس اگر بافتتون رو با فرمالین فیکس کردین حتما از فلوروکرومی با طیف رنگی قرمز استفاده کنین که سیگنال اصلیتون رو با autofluorescence اشتباه نگیرین.

۹- دلیل بعدی میتونه بالا بدن بیش از حد دمای انکوباسیون بافت با انتی بادی اولیه و ثانویه باشه..
در اینصورت باید دمای انکوباسیونتون رو کم کنین.. مثلا دما رو برسونین به ۴ درجه.

۱۰- ممکنه شما در مرحله ی Blocking انزیم های endogenouse خوب عمل نکرده باشین و یا اصلا این مرحله رو انجام نداده باشین.
یادتون نره که حتما اگر از نشانگر های انزیمی استفاده میکنین برای block کردن انزیم پراکسیداز درونی باید بافتتون رو با H2O2 (0 .3% v/v) و برای block کردن انزیم الکالین فسفاتاز بافتتون رو با levamisol (2 mM) انکوبه کنین.

آخرین مورد بررسی دلایل ایجاد اسیب در بافت نمونه و راه های بر طرف کردن آن است.

۱- یک دلیل رایج در ایجاد اسیب به بافت نمونه میتونه این باشه که شما مرحله ی بازارایی انتی ژنی رو خیلی خشن انجام دادین..
در اینصورت باید با نحوه ی انجام بازارایی انتی ژنتی رو عوض کنین.. حواستون باشه که در این مرحله خیلی با بافتتون با ملایمت رفتار کنین و اصلا سعی نکنین زود مرحله تموم بشه…

۲- دلیل مهم بعدی بد فیکس کردن بافتتونه.. یعنی بافت رو خوب فیکس نکردین.
مدت زمان فیکس کردن رو افزایش بدین.
نسبت ماده ی فیکساتیو به بافت رو زیاد کنین.
تکه های کوچکتری از بافت رو ببرین تا بهتر در ماده ی فیکساتیوتون غوطه ور بشه.

۳- ممکنه مرفولوژی بافتتون به راحتی قابل مشاهده نباشه..
باید تکه های نازکتری از بافت رو برای بررسی انتخاب کنین.
اگر از تکنیک freeze کردن برای فیکس بافت استفاده کردین حواستون باشه به هیچ عنوان در بافت تکه های کریستای یخ ایجاد نشه.. چون کریستال های بخ مرفولوژی بافتتون رو خراب میکنه و مجبورین دوباره بافت رو فیکس کنین.

۴- ممکنه بافتتون روی اسلاید چروک شده باشه و یا حباب بین اسلاید coverslip تون ایجاد شده باشه.
حتما مرحله ی دهیدراسیون ( ابگیری) رو قبل از mounting انجام بدین.
موقع قرار دادن coverslip بر روی اسلایدتون خیلی دقت کنین.
اگر باز هم این مشکل رو داشتین در این صورت باید نواحی چروک خورده رو با دقت جدا کنین ( خیلیی سخت و نفس گیره)
سعی کنین نواحی ای از بافت رو بررسی کنین که سالم باشن.

خوب همراهان عزیز خسته نباشین… بررسی مراحل troubleshooting تکنیک ایمونوهیستوشیمی تموم شد… ما سعی کردین تا اونجا که تجربه مون اجازه میداد تمام دلایل ایجاد خطا در این تکنیک رو با راه حل هاش براتون باز کنیم…
امیدوارم خوب و با دقت تمام مراحل ، دلایل و راه های رفع خطا در این تکنیک رو مطالعه کنین.. باز هم اگر سوالی داشتین حتما حتما با من در قسمت دیدگاه در میون بذارین…
یادتون باشه که هیچوقت در دنیای علم هیچ مسئله ای رو بدون دونستن دلیلش قبول نکنین و هیچ مرحله از تکنیکی رو بدون اینکه علت انجامش رو بدونین انجام ندین.. این نکته مهمترین راه حل برای کم کردن میزان خطا در کارتونه…

موفق باشید.

print
Tags: ,


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

یازده − شش =