ایمونوهیستوشیمی (Immunohistochemistry)

مبحث ایمونوهیستوشیمی مبحث بسیار گستده ایست که ما قصد داریم در مورد هدف از انجام این تکنیک، مراحل اون ، پروتکل انجام کار و راهکار های troubleshooting در این تکنیک با هم بحث کنیم…

خوب اولین سوال این هست که اصلا این تکنیک چیه؟؟؟ چی میخواد بگه؟؟؟
ببینین دوستان این تکنیک یک روش برای شناسایی پروتئین های مورد نظر ما در بافت مورد ازمایشمونه…
برای درک بهتر بیاین اصلا این واژه رو با هم بشکافیم:
واژه ی Immuno در این تکنیک بر میگرده به اساس این روش که شناسایی پروتئین ها بر مبنای اتصالات و میانکنش های انتی ژن با انتی بادیه.. یعنی ما در این تکنیک با به کار گیری انتی بادی های مکمل با انتی ژن مورد بررسیمون وجود پروتئین مورد نظر رو در بافتمون و همچنین میزان بیانش رو میسنجیم…
واژه ی histo در این تکنیک به این معناست که ما از در این روش از بافت به عنوان نمونه استفاده میکنیم یعنی ما به دنبال شناسایی پروتئین های موجود در بافت هستیم نه سلول..
واژه Chemistry هم به معنای ایجاد شرایط واکنش در این تنیکه…
پس با یک جمع بندی کلی متوجه میشیم که هدف ما در این تکنیک بررسی میزان یک پروتئین خاص در بافته..
حالا نکته ی جذاب اینجاست که ما با کمک این تکنیک نه تنها میزان پروتئین را میفهمیم بلکه میتونیم جایگاه پروتئین رو در درون سلول های بافت نیز شناسایی کنیم..

شکل زیر به صورت نمایشی نحوه ی کار تکنیک ایمونوهیستوشیمی رو نشون میده…

خوب حالا که با اساس این تکنیک اشنا شدیم و دیدیم که چه اطلاعات مفیدی رو در اختیارمون قرار میده بیاین با هم مراحل انجام کار رو بصورت کلی نام ببریم و بعد هر مرحله رو جداگانه با هم بررسی کنیم…
مراحل انجام کار به ترتیب زیره:
۱- مرحله ی اماده سازی نمونه
۲- مرحله ی Antigene Retrieval
۳- مرحله ی Blocking
۴- مرحله ی Immunostaining
۵- مرحله ی Counterstaining
۶- مرحله ی Dehydration and mounting
۷- مرحله ی مشاهده با میکروسکوپ

یه سوال این تکنیک شما رو یاد یه تکنیک مشابه نمیندازه؟؟؟
درسته خیلی از مراحل این تکنیک شبیه تکنیک وسترن بلاته که ما قبلا مفصل در موردش با هم حرف زدیم که هم در کانال و هم در سایت اطلاعاتش موجوده… اما لازمه بهتون بگم که تکنیک وسترن بلات از لحاظ دقت در اندازه گیری میزان پروتئین خاص و حساسیت بالاتر از تکنیک ایمونوهیستوشیمیه.. و از سوی دیگه مراحل پروسسینگ انتی ژن در روش وسترن با این روش فرق میکنه که باعث میشه روند اتصال انتی ژن – انتی بادی در این رو روش با هم متفاوت بشه چون انتی ژن در این روش بیشتر به حالت طبیعی خودش نزدیکه اما در روش وسترن بلات بخاطر مراحلی چون SDS-Page ، استفاده از بافرهای خاص و یا حرارت تا حدودی ساختار انتی ژن رو تغییر میده…

پس شما اول باید هدفتون رو از بررسی پروتئین معلوم کنین اگر هدفتون مقایسه ی بین بافت ها و یا جایگیری پروتئین در یافت و مانند ایناست این تکنیک خیلی کارامده اما اگر مقدار کمی خیلی دقیق میخواین بهتره از وسترن بلات استفاده کنین…

خوب دیگه مقدمه گویی بسه… حالا میخوایم در کنار هم تک تک این مراحل رو جداگانه بصورت مفصل با هم بررسی کنیم.. میخوام وقتی مطلب تموم شد هر سوالی که راجع به این تکنیک ازتون پرسیدن شما سریع و بدون شک جوابش رو بدونین… پس با دقت مطلب رو بخونین و اگر سوالی داشتین حتما حتما از من بپرسین…

همونطور که اشاره کردیم مرحله ی اول تکنیک مرحله ی اماده سازی بافته… خود اماده سازی بافت از چند مرحله ی جداگانه تشکیل میشه…
اولین مرحله ، فیکس کردن بافته… چرا؟؟؟ چرا باید بافت رو فیکس کنیم؟؟ اصلا فیکس کردن یعنی چی؟؟
ببینین دوستان ما هدفمون اینه که تا اونجایی که ممکنه بافتمون سالم در هر حالت طبیعی بررسی بشه… یعنی چی در حالت طبیعی؟؟؟ یعنی باید سعی کنیم انتی ژن ها در طی مراحل مختلف ثابت باشن و از سوی دیگه بافتمون از لجاظ ساختار و مرفولوژی سلولی تغییر نکنه…
فیکس کردن باعث حفظ ساختار سلولی در بافت ها ، ممانعت از اتولیز و نکروز سلولی ، حفظ انتی ژنیسیته و حفظ ساختار و مرفولوژی سلولی میشه… پس قبول کنین که مرحله ی مهمیه…
دومین مرحله ی اماده سازی بافتی به دو حالت تقسیم میشه که شما میتونین بر اساس شرایط کاریتون یکیش رو انتخاب کنین…
۱- غوطه ور کردن بافت در پارافین
۲- منجمد کردن بافت
ببینین همه ی کارها در راستای فیکس کردن و ثابت نگه داشتن ویژگی های بافتی انجام میشه و هر کدوم خوبی ها و بدی های خودش رو داره…
من هر کدومش رو جداگانه براتون توضیح میدم و بعد با هم دو روش رو مقایسه میکنیم…

ابتدا روش غوطه ور کردن بافت در پارافینParaffin-embedded tissue رو توضیح میدیم.
برای انجام اینکار شما باید ابتدا با کمک فرمالین بافتتون رو فیکس کنین.. دو روش برای فیکس کردن بافت وجود داره
۱- اینکه ماده ی فیکساتیو رو به از طریق وریدی به حیوان تزریق کنین که بهش میگن Perfusion fixation که این تزریق بیشتر در نواحی قلب و ناحیه ی abdominal انجام میشه.
ماده ی فیکساتیو در این روش ۴% paraformaldehyde هست.
۲- روش بعدی غوطه ور کردن بافت در ماده ی فیکساتیوه.. که برای این کار عموما از ۱۰% neutral buffered formalin (NBF) استفاده میشه…
پروتکل این روش اینجوریه که شما باید بافت مورد نظرتون رو در درون این ماده ی فیکسانیو به مدت چند ساعت غوطه ور نگه دارین.. اینکه زمانش چقدر باشه بستگی به ضخامت و نوع بافتتون داره اما عموما بهترین زمان بین ۱۸ تا ۲۴ ساعته…
حواستون باشه اگر مدت زمان غوطه وری کم باشه فیکس شدن درست صورت نمیگیره و باعث میشه که شما در اطراف و لبه های بافت نسبت به مرکز بافت سیگنال بیشتری دریافت کنین یعنی پراکندگیتون یکسان نمیشه…
از طرفی اگر زمان فیکس کردن بیشتر از حد باشه از دقت کارتن کم میشه چون باعث میشه انتی ژن ها پوشیده بشن و نتونن توسط انتی بادی ها شناسایی بشن..

خوب بعد از اینکه با یکی از روش های بالا بافتتون رو فیکس کردین باید بافتتون رو در پارافین غوطه ور کنین.. اما مشکل اینجاست که پارافین در اب قابلیت حل شدن نداره پس باید قبل از اینکه بافت رو در پارافین بذارین پروسه ی ابگیری رو انجام بدین که یک پروسه ی راحت اما وقت گیره…
پروسه ی ابگیری با ایجاد یک گرادیان افزایش غلظت یک ماده ی مخصوص ابگیری مثل الکل و غوطه ور کردن بافت در اون انجام میشه…

پس ما باید یک گرادیانت غلظتی از یک مدل الکل درست کنیم و در مدت زمان های مشخصی بافت رو در اون قرار بدیم…
این گردایان از اتانول ۷۰ % شروع میشه ، بعد اتانول ۹۰% و بعد اتانول ۱۰۰%. به این صورت که سه بار بافت رو در اتانول ۷۰% به مدت نیم ساعت قرار میدین، بعد دو بار به مدت نیم ساعت در اتانول ۹۰% و بعد سه بار به مدت نیم ساعت در اتانول ۱۰۰%. اینکار باید در دمای اتاق انجام بشه…
یادتون باشه که این کار باعث تغییر در هیدروفوبیسیتی و ممانعت از اسیب به سلول میشه…

بعد از انجام پروسه ی ابگیری باید مواد کار از روی بافت شسته بشن که برای اینکار از xylene استفاده میکنیم. به این صورت که سه بار به مدت نیم ساعت در دمای اتاق بافت رو در xylene غوطه ور میکنیم…
حواستون باشه که بسته به نوع بافت و اندازه و تجربه این زمان ها میتونه متغیر باشه اما مواد و دمای اتاق همیشه ثابته….
خوب حالا که الکل ها رو از روی بافت شستیم باید بافت رو در پارافینی که در دمای تقریبا ۵۸ تا ۶۳ درجه هست دو بار به مدت ۲۰ دقیقه غوطه ور کنیم بعد از غوطه ور سازی باید پارافین و بافت رو در مای سرد قرار بدیم تا پارافین خودش رو بگیره که این پروسه عموما از ۲۰ دقیقه تا یک overnight متغیره…..

برای اینکار دستگاه مخصوصی وجود داره که من فیلمش رو در انتهای مبحث امروز براتون میزارم تا کاملا به پروسه ی انجام کار اگاه بشین…
وقتی پارافین خودش رو گرفت اونوقت با استفاده از دستگاه میکروتوم بافت رو به قطعاتی با ضخامت ۵ – ۱۵ µm میبریم…
یادتون باشه که میتونین این قطعات رو به مدت طولانی در دمای اتاق نگهدارین…
Paraffin-embedded tissue

دستگاه میکروتوم برای برش قطعات پارافینی

دستگاه میکروتوم برای برش قطعات پارافینی

خوب همون طور که گفتیم یک روش دیگری هم برای نگهداری بافت ها وجود داره و اونهم روش منجمد کردن بافته…
در این روش بافت در نیتروژن مایع و ایزوپنتن غوطه ور میشه و یا میتونه در یخ خشک مدفون بمونه…بعد از انجماد بافت میتونیم اون رو با دستگاه cryostat برش بزنیم… قطعات برش خورده میتونن به مدت یکسال در دمای ۸۰- نگهداری بشن..

یه سوال بنظرتون چه زمانی باید از روش منجمد کردن بافت استفاده کنیم؟؟؟
زمانی که میخواهیم مراحل Post modification مثل فسفریلاسیون رو بررسی کنیم چون در این حالت فعالیت های انزیمی بافت حفظ میشه…..
در روش غوطه وری به پارافین سبب کاهش سیگنال دهی انتی ژن های فسفریله میشه پس بهتره در مطالعات مربوط به پروتئین های مسیر سیگنالینگ و بررسی فسفریلاسیون از بافت های منجمد استفاده کنین…

نمایی از یک بافت منجمد در دستگاه برش

نمایی از یک بافت منجمد در دستگاه برش

حالا که هر دو روش رو یاد گرفتین بنظرتون چه تفاوتی بین این دو روش هست؟؟؟ کدوم بهتره؟؟؟
هر کدوم از این دو روش خوبی ها و بدی های خودش رو داره…
مثلا در روش Paraffin-embedded tissue مرفولوژی سلول و ساختار بافت بهتر حفظ میشه و از طرفی مدت زمان بیشتری میتونین بافت رو نگه دارین… اما چونکه بافت در دمای بالا در پارافین غوطه ور میشه ممکنه در سختار انتی ژن ها تغییر ایجاد کنه و در رنگپذیری اونها تاثیر بدی بگذاره…
در روش Frozen tissue عملکرد انزیمی حفظ میشه و از طرفی مدت زمان انجام کار نسبت به روش پارافین کمتره اما به جاش دقت کار باید بالا باشه و سرعت منجمد کردن بافت خیلی مهمه چون ممکنه در ساختار بافت کریستال ایجاد کنه و از طرفی برش زدن بافت هم دشواره چون ممکنه بافت در حین برش خوردن خورد بشه…

مقایسه ی دو روش Paraffin-embedded tissue و Frozen tissue

مقایسه ی دو روش Paraffin-embedded tissue و Frozen tissueاین جدول مواد فیکساتیو متنوعی رو بر اساس نوع انتی ژنی که میخواین بررسیش کنین بهتون نشون میده..

خوب تا اینجای کار خسته نباشین.. ما تا الان یاد گرفتیم که چطوری نمونه مون رو برای انجام تکنیک ایمونوهیستوشیمی اماده کنیم…
از اینجا به بعد روشی که دنبال میکنیم روش Paraffin-embedded tissue هستش البته خیلی دو روش با هم فرق ندارن اما من امروز مراحل کار با نمونه های پارافینی رو براتون توضیح میدم…
میدونم خسته شدین و مطلب تا اینجا کمی سنگین بوده اما چون نمیخوام توضیح این تکنیک چندین روز طول بکشه بذارین مرحله ی بعدی رو هم برسی کنیم…
یعنی مرحله ی بازارایی انتی ژن( Antigen retrieval) 
البته یکسری کار هست که شما باید قبل از مرحله ی Antigen retrieval انجام بدین :
ببینین دوستان وقتی که شما نمونه هاتون رو در پارافین غوطه ور کردین و پارافین خودشو گرفت بعدش با دستگاه میکروتوم بافتتون رو به قطعات معینی برش زدیم.. حالا باید پارافین رو از بافتتون جدا کنین… چون ما به بافت خالصمون برای بررسی های بیشتر احتیاج داریم…

برای اینکار ابتدا قطعه ی بافتی همراه با پارافین رو به slide های دارای بار مثبت منتقل میکنیم. بار مثبت باعث میشه که بافت راحتر به slide بچسبه.. حالا برای بالا بردن میزان چسبندگی باید slide ها رو حرارت بدین که یا میتونین یه overnight در دمای اتاق نگهش دارین یا برای چند ساعت بذارینش توی انکوباتور با دمای ۵۰ درجه..
بعد از اتصال بافت به slide باید بافت رو از پارافین خالص کنین که برای اینکار باید این بار بافت رو ابدهی کنین یعنی دقیقا برعکس بار قبل که ابگیری کرده بودین..
دقت کنین که این مرحله خیلی در جوابدهی درست اهمیت داره…
این بار برای ابدهی باید ابتدا slide رو دو بار به مدت ۱۰ دقیقه در xylene غوطه ور کنین تا شسته بشه بعدش دو تا ده دقیقه در اتانول ۱۰۰% ، ۵ دقیقه در اتانول ۹۵% ، ۵ دقیقه در اتانول ۷۵% و ۵ دقیقه در اتانول ۵۰ % نگهش دارین…
حواستون باشه که مدت زمان و دفعات غوطه وری بافت در الکل ها در پروتکل های مختلف فرق میکنه اما هدف همشون یکیه پس شما باید بر اساس نوع بافت و تجربه بهترین زمان برای کار خودتون انتخاب کنین…
بعد از این مرحله بافتتون رو با اب استریل و یا wash buffer کامل بشورین و دیگه اجازه ندین که Slide تون خشک بشه چون کیفیت کارتون پایین میاد و ممکنه لکه گذاری های غیر اختصاصی داشته باشین.

خوب حالا دیگه نمونه ی ما کاملا برای شروع کار اماده است…
یادتونه بهتون گفتم ممکنه مرحله ی fixation اگر به مدت زیاد انجام بشه اپی توپ های انتی ژن های بافت رو بپوشونه؟؟؟ از اونجا که همیشه باید جانب احتیاط رو نگهداریم بهتون پیشنهاد میکنم حتما قبل از ورود به مرحله ی اضافه کردن انتی بادی ها مرحله ی Antigen Retrievalرو انجام بدین.. بخصوص اگر از فرمالین برای فیکس کردن استفاده کردین چون فرمالین با اپی توپ های انتی ژن cross link برقرار میکنه و اونها رو میپوشونه برای همین شما باید انتی ژن ها رو بازیابی کنین…
دو حالت برای بازیابی انتی ژن ها وجود داره یکی روش انزیمی و دیگری روش حرارتی…
این روشها چی هستن؟؟؟ چه تفاوتی دارن؟؟؟؟

روش انزیمی یا Proteolytic-Induced Epitope Retrieval (PIER) روشی مبتنی بر استفاده از انزیم هایی چون پروتئینازk ، تریپسین و یا پپسین هست که در PH=7.4 در دمای ۳۷ درجه به مدت ۱۰ تا ۳۰ دقیقه نمونه رو در انها انکوبه میکنیم که به کمک عملکرد این انزیم ها اپی توپ ها ازاد شده و راحت تر در دسترس انتی بادی قرار میگیرند..
اما باید حواستون باشه که استفاده از این روش بعضی وقت ها سبب اسیب به ساختار یافتتون میشه پس باید خیلی به مرحله ی set up غلظت انزیم ها و مدت زمان انکوباسیون دقت کنین که کاملا هم بستگی به بافتتون داره…

روش حرارتی و یا HIER) Heat-Induced Epitope Retrieval) روشی میتنی بر حرارت دادن نمونه ی بافتی ست که این حرارت میتونه از راه های متنوعی از جمله مایکروویو ، pressure cooker، دستگاه بخار و یا اتوکلاو تولید بشه… PH در این روش باید تا حدودی بالا باشه که بخاطر ان از بافر Citrate pH 6 buffers استفاده میشخه. البته باید بدونین که بهترین PH برای کار شما به صورت تجربی بدست میاد…
بهترین دما در این روش دمای ۹۵ درجه است.. و زمان انکوباسیون به صورت تقریبی ۲۰ دقیقه است. بافرهایی که در این روش استفاده میکنین کاملا بستگی به PH ای داره که میخواین باهاش کار کنین اما رایج ترین بافر ها بافر هایEDTA ، sodium citrate و Tris-EDTA هستش.. سدیم سیترات PH=6 داره و تریس ا د ت ا PH=9 داره و اینها از رایجترین بافر های این روش هستن.
از بدی های این روش اینه که اگر از مایکروویو استفاده کنین ممکنه حرارت بصورت یکنواخت پخش نشه و برخی نواحی خوب دچار بازارایی انتی ژن نشه.. در روش جوشوندن هم ممکنه بخاطر نوع حرارت بافتتون از slide کنده و جدا بشه…
پس حواستون باشه که تو این مرحله تجربه و دقت حرف اول رو میزنه…

این شکل نقش انواع PH ها رو در باز ارایی بهتر انتی ژن در روش حرارتی نشون میده.. ببینین هر انتی ژنی در یک PH مشخص بهتر بازارایی میشه برای همین نمیتونیم از یک فرمول کلی برای همه ی انتی ژن ها استفاده کنیم..

 نقش انواع PH ها رو در باز ارایی بهتر انتی ژن این شکل مبنای عملکرد بازارایی انتی ژن رو بهمون نشون میده..

این شکل مبنای عملکرد بازارایی انتی ژن رو بهمون نشون میده شکل زیر هم تفاوت رنگ امیزی رو در دو حالت بدون بازارایی انتی ژن و با بازارایی انتی ژن بهمون نشون میده.. ببینین چقدر تفاوت مشهوده!!!

این شکل هم تفاوت رنگ امیزی رو در دو حالت بدون بازارایی انتی ژن و با بازارایی انتی ژن بهمون نشون میده.. ببینین چقدر تفاوت مشهوده!!!

شکل زیر هم انواع بافر ها و روش های بازارایی انتی ژن رو برای CD4 و CyclinD1 نشون میده.. ببینین هر روشی شکل رنگ امیزی مخصوص به خودش رو داره پس اینکه شما از کدوم روش استفاده کنین کاملا تجربیه…

مرحله ی بعد مرحله ی Blocking است.

عزیزانی که ما رو در مبحث وسترن بلات همراهی کرده ان حتما الان با واژه ی Blocking و هدف از انجام اون کاملا اشنایی دارن اما دوستان Blocking در ایمونوهیستوشیمی تا حدودی با روش وسترن بلات متفاوته در اینجا ما انواع مختلفی از Bocking رو داریم که بر اساس نوع کارمون باید یکیش رو انتخاب کنیم…
اول بیاین برای کسانیکه احتمالا در تکنیک وسترن بلات همراه ما نبودن ابتدا Blocking رو توضیح بدیم:
ببین دوستان Blocking به منظور رفع هرگونه اتصالات غیر اختصاصی بین انتی بادی مورد استفاده ی ما با هرگونه اپی توپ از انتی ژن های غیر هدف در نمونه مونه…. یعنی اینکه ما باید هر گونه اپی توپ انتی ژنی رو به غیر از انتی ژن های مد نظرمون بلاک کنیم تا خدایی نکرده اتصالات غیر ضروری بین انتی بادی ما با هرگونه انتی ژنی به غیر انتی ژن مدنظرمون اتفاق نیوفته…

تا اینجای کار این مرحله ی خیلی شبیه به مرحله ی Blocking در وسترن بلاته.. در ایمونوهیستوشیکی هر پروتئیینی که affinity و تمایل به اتصال کمی با پروتئین مدنظر ما رو داشته باشه میتونیم برای Blocking استفاده کنیم..
سرم ها عموما مواد خیلی خوبی برای Block کردن انتی ژن های غیر اختصاصی هستند.. چرا؟؟؟؟ چونکه عموما ترکیبی از انواع انتی بادی هایی هستند که به نواحی غیر اختصاصی متصل میشن…
یک نکته ی خیلی مهم در انتخاب نوع سرم و اینکه از چه موجودی گرفته شده باشه اینه که سرمی که انتخاب میکنین عموما از همون موجودی باشه که انتی بادی ثانویه تون از اون موجوده اینکار احتمال بروز خطا در کارتون رو کم میکنه…

از مواد بلاک کننده ی رایج دیگه میتونیم به BSA و یا کازئین اشاره بکنیم… براتون اشنا نیستن؟؟؟؟ چرا همونایین که در وسترن هم به عنوان ماده ی بلاک کننده استفاده میشدن…
استفاده از اینا برای بلاک کردن نسبت به سرم راحتتره چون دیگه نیازی نیست که با انتی بادی ثانویه ای که استفاده میکنین match باشه..

برای بلاک کردن انتی ژن های غیر ضروری در بافتتون لازمه که مقدار ۱۰۰–۴۰۰ µl ماده ی بلاک کننده ( که عموما از ۱۰% سرم نرمال با ۱% BSA در TBS تشکیل شده و یا سرم موجودیست که انتی بادی ثانویه تون رو ازش گرفتین ) به مدت یک تا دوساعت در دمای اتاق در محفظه های مرطوب انکوبه کنین..

خوب تا اینجاش که خیلی شبیه به بلاک کردن در وسترن بلات بود اما در روش ایمونوهیستوشیمی بلاک کردن مراحل دیگری هم داره که کاملا بستگی به روش انتخابی شما برای نشاندار کردن انتی ژن هاتون داره…
ببینین ما به طور کلی راه های متنوعی برای بلاک کردن بر مبنای نشاندار کردن انتی ژن های مورد هدفمون داریم که الان تک تک اونها رو با هم بررسی میکنیم:

بلاک کردن از نوع Biotin blocking: اگر شما قصد دارین از طریق میانکنش بین بیوتین و اویدین انتی ژن هاتون رو شناسایی کنین لازمه که تمام بیوتین های درونی Endogenous biotinبافتتون رو که ممکنه با انتی بادی ای که روش اویدین سوار شده میانکنش بده و لکه های غیر اختصاصی ایجاد کنه رو بلاک کنین…

بیشترین بافت هایی که بیوتین درونی بالایی دارند بافت های کلیه ، کبد و مغز هستند.
حواستون باشه که حتما مرحله ی بلاک کردن باید قبل از اضافه کردن انتی بادی ثانویه انجام بشه…
از طرف دیگه بلاک کردن انتی ژن های غیر اختصاصی باید قبل از بلاک کردن بیوتین های درونی با بافر های avidin-biotin block باشه…

بلاک کردن از نوع Peroxidase blocking:
اگر مبنای شناسایی انتی ژن های هدفتون بر اساس استفاده از انتی بادی های متصل به انزیم horseradish peroxidase (HRP) هستش لازمه که از این نوع بلاکینگ استفاده کنین تا فعالیت تمام انزیم های پراکسیداری درونی در بافتتون رو از خاموش کنین …
بیشترین بافت هایی که فعالیت پراکسیدازی بالایی دارن بافت های کبد ، کلیه و عروق خونی هستند.
حواستون باشه که اگر اینکار رو نکنین در موقع شناسایی پروتئین های هدفتون یک عالمه لکه های غیر اختصاصی میبینین..

یک نکته ی جالب خیلی ها برای اینکه مطمئن بشن بافتشون فعالیت پراکسیدازی درونی بالایی داره قبل از اینکه این انزیم ها رو بلاک بکنن میان قبل از اینکه انتی بادی شون رو به بافت بزنن ابتدا ماده ی DAB که الان همتون میدونین سوبسترای HRP هستش و وقتی به کمک این انزیم اکسید میشه از خودش رنگ قهواه ای تولید میکنه رو به بافت اضافه میکنن اگر بافتشون قهوه ای شد یعنی فعالیت پراکسیدازی درونی داره پس حالا اول پراکسیداز های درونی رو بلاک میکنن و بعدش انتی بادی رو اضافه میکنن.

بنظرتون چه ماده ای برای بلاک کردن انزیم های پراکسدازی درونی بافت ها لازمه؟؟؟
بله درسته بر اساس ماهیت پراکسیدازی انزیم HRP بهترین ماده ی بلاک کننده برای اون اب اکسیژنه یا همون H2O2 هستش..
برای اینکار شما لازمه H2O2 ی عموما ۰٫۳% رو که با TBS مخلوط شده به مدت ۱۰ تا ۱۵ دقیقه در دمای اتاق به بافتتون اضافه کنین. ( البته گاهی وقت ها تا یکساعت هم ممکنه زمان انکوباشیون طول بکشه که این مدت بستگی به غظت H2O2 تون داره) بعد از این مدت slide حاوی بافت رو دو بار با wash buffer و یا اب استریل بشورین.
الان ممکنه از من بپرسین بهترین زمان هایی که باید H2O2 رو اضافه کنیم چه زمانیه؟
این مسئله بستگی به نوع کارتون داره و شما بر اساس تجربه و جواب هایی که از کارتون گرفتین متوجهش میشین.. اما به طور کلی شما میتونین قبل از بعد از مرحله ی دپارافینه کردن بافت ، بعد از بازارایی انتی ژن و یا بعد از اضافه کردن انتی بادی اولیه و یا انتی بادی ثانویه تون این کار رو انجام بدین.

مثلا اگر دارین به دنبال پروتئین هایی با مارکر های CD4 و یا CD8 در بافتتون میگردین حتما حتما بعد از مرحله ی اضافه کردن انتی بادی اولیه و ثانویه تون از H2O2 استفاده کنین… چرا؟؟؟؟؟ چونکه H2O2 با ساختار شیمیایی که داره باعث تخریب شدن ساختار اتی ژنی این مارکر ها میشه وشناسایی رو غیر ممکن میکنه…

شکل زیر به خوبی دلیل بلاک کردن انزیم های پراکسیدازی درونی رو در بافت ها نشون میده..

 بلاک کردن انزیم های پراکسیدازی درونیدر شکل زیر سمت چپ انزیم های پراکسیدازی درونی در بافت مهار نشدن.. ببینین چقدر لکه های false positive مشاهده میشه نیمی از این لکه ها صرفا نتیجه ی فعالیت انزیم های پراکسیدازی درونی بافت است.

انزیم های پراکسیدازی درونی

خوب سومین مدل بلاک کردن Alkaline phosphatase blocking هستش که در صورتی که شما از انتی بادی های کانجوگه با انزیم الکالین فسفاتاز (AP) استفاده میکنین کارایی داره..
بافت هایی که به صورت طبیعی بیان بالایی از انزیم الکلاین فسفاتاز رو دارن شامل بافت های کبد ، روده ، استئوبلاست و پلاسنتا هستند.
اگر از بافت های فریز ده برای ایمونوهیستوشیمی استفاده کنین نیازی به اینکار ندارین چرا؟؟ چون در بافت های منجمد این انزیم غیر فعال میشه…

ماده ی بلاک کننده این انزیم، levisamole نام داره و پروتکل اضافه کردنش مشابه پروتکل بلاک کردت انزیم HRP هست.
یک نکته که خیلی ها نمیدونن اینه که اگز شما دارین با بافت روده ای کار میکنین بهتره از levisamole استفاده نکنین چون این ماده در روده کارایی نداره و برای بلاک کردن انزیم AP در روده قبل از اضافه کردن انتی بادی اولیه بافت رو با یک اسید ضعیف انکوبه کنین.

و در نهایت اخرین مدل بلاک کردن در این تکنیک راهکاری برای کاهش اتوفلورسنتیسیته ی برخی بافت ها است.
یعنی چی ؟؟ مگه بافت ها از خودشون نور فلورسنت ساطع میکنن؟؟؟
بله دوستان من… برخی بافت ها هستند که به طور طبیعی مواد فلورسنتی مثل فلاوین و پورفیرین دارن… پس اگر شما از انتی بادی های نشاندار با مواد فلورسنت استفاده کنین ممکنه این مواد در کارتون اختلال ایجاد کنن و جواب های false positive بهتون بدن.
اگر از یافت های منجمد برای کارتون استفاده کنین این مواد به طور طبیعی کاراییشون رو از دست میدن.

حواستون باشه که مهمترین مرحله که باعث ساطع کردن نور فلورسنت در این بافت ها میشه مرحله ی فیکس کردن بافت با مواد الدهید داره که با امین این مواد ترکیب میشه و نور فلورسنت ایجاد میکنه.
پس دقت کنین که قبل از شروع کارتون مطمئن باشین که بافتتون دارای مواد فلورسنت هست یا نه اگر بود بهتره که از رنگ امیزی با مواد کروموژن و رنگی مثل DAB استفاده کنین و یا اگر نمیتونین باید در مرحله ی فیکس کردن اثر الدهید ها رو روی مواد با اضافه کردن سدیم بروماید و گلایسین/لایرین بلاک کنین.
خوب تا اینجای کار خسته نباشین.. ما تا الان بافت هامون رو بعد از اماده سازی بازارایی انتی ژنی کردیم و بعدش هم اونها رو با بافر ها و مواد بلاک کننده ی انزیم های درونی تیار کردیم. الان دیگه نوبت میرسه به اصلی ترین مرحله ی کار که اونهم اضافه کردن انتی بادی های اولیه و ثانویه به بافتمونه…
میدونم که اکثرتون میدونین که دو حالت مختلف برای نساندار کردن پروتئین های هدف در این تکنیک وجود داره … حالت مستقیم و حالت غیر مستقیم…
هر کدام از دو حالت بالا مزایا و معایت خودشون رو دارن… حالا بیاین هر کدوم از این روش ها رو جداگانه با هم بررسی کنیم…

روش مستقیم:
در این حالت ما فقط از یک مدل انتی بادی یعنی فقط از انتی بادی اولیه استفاده میکنیم. این انتی بادی متصل به یک انزیم مثل HRP و یا AP یا فلوروکروم هستش که با اضافه مردن سوبسترا از خودش رنگ ساطع میکنه..
از این حالت بیشتر در مواقعی استفاده میشه که میدونیم بافت مورد بررسیمون بیان بالایی از انتی ژن های هدفمون رو داره…
از مزایای این روش راحت تر بودن و سریعتر بودنشه چرا چون دیگه دغدغه ی استفاده از انتی بادی ثانویه و set up کردنش رو نداریم.
اما از معایب این روش ضعیف بودنشه و اینکه حساست ان نسبت به روش غیر مستقیم کمتره…

روش غیر مستقیم:
در این حالت شما باید بعد از اضافه کردن انتی بادی اولیه به بافت ، از انتی بادی ثانویه که به IgG انتی بادی اولیه ( از یک گونه ی دیگه ) متصل میشه استفاده کنین. در این حالت انتی بادی ثانویه ی شما است که متصل به انزیم های HRP و یا AP و مواد فلوروکرومه…
نکته ای که باید در اینجا رعایت بشه اینه که حتما گونه ای که انتی بادی ثانویه تون رو ازش گرفتین باید با گونه ای که انتی بادی اولیه رو ازش گرفتین متفاوت باشه…
بیاین با مثال بهتر متوجه بشیم.. مثلا اگر انتی بادی اولیه تون رو از موش گرفتین انتی بادی ثانویه باید مکمل انتی بادی اولیه اما از موجودی به غیر از موش مثلا خرگوش باشه..

از این حالت بیشتر در مواقعی استفاده میشه که ما میزان پروتئین هدفمون در بافت خیلی زیاد نیست و نیاز به بالا بودن دقت کار داریم.
از مزایای این روش بالا بودن دقت و اختصاصیت کاره… و از سوی دیگه در این روش شما میتونین از چندین انتی بادی ثانویه برای اتصال به انتی بادی اولیه استفاده کنین که در این صورت دقت کارتون خیلیییی بالا تر میره…
اما خوب معایت این روش زمان بر بودن اونه.. چون استفاده از انتی بادی ثانویه نیاز به set up کردن مرحله و مراحل بلاک کردن و کنترل های بیشتر داره…

مقایسه ی دو روش مستقیم و غیر مستقیم اتصال انتی ژن – انتی بادی

مقایسه ی دو روش مستقیم و غیر مستقیم اتصال انتی ژن - انتی بادی

بر اساس روش غیر مستقیم دو مدل اتصال نشاندار کردن در تکنیک ایمونوهیستوشیمی پایه گذاری شده :
مدل اول اسمش peroxidase, anti-peroxidase (PAP) antibody method هست که نسبت به حالت های دیگه حساسیت بالا تری داره و background کمتری ایجاد میکنه.
در این حالت ابتدا انتی بادی اولی از یک گونه ی خاص با انتی ژن متصل شده و سپس انتی بادی ثانویه از ناحیه ی Fab به انتی بادی اولیه متصل میشه و از Fab دیگرش به انتی بادی سوم که دارای انزیم HRP هست متصل میشه و روی اون انتی بادی برای انتی بادی سوم قرار میکیره.. این مدل دقت خیلی بالایی داره و برای مواقعی هست که شما نیاز به اختصاصیت و دقت بالایی در پیدا کردن پروتئین مورد نظرتون دارین..

مکانیسم عمل سیستم PAP

مکانیسم عمل سیستم PAP

و در نهایت اخرین مدل که متد Labeled Steptavidin-Biotin (LSAB) نام داره.
این تکنیک از رایج ترین تکنیک ای مورد استفاده در ایمونوهیستوشیمیه.. در این روش در این روش آنتی بادی اولیه با بافت انکوبه شده و سپس آنتی بادی ثانویه کنژوگه شده با بیوتین اضافه میشود بیوتین یک ویتامین با میل ترکیبی بالا برای موادی مانند آویدین و یا استرپتو آویدین(از باکتری استرپتوکوک آویدین به دست میاید) است . در نهایت به این مجموعه کمپلکس استرپتو آویدین کنژوگه با HRP(hourse radish peroxidase) اضافه میشود. در اثر اتصال استرپتو آویدین به بیوتین موجود در کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی HRP آزاد شده و با اثر روی سوبسترا ایجاد رنگ میکند.
همین تکنیک به صورت ( Avidin-Biotin Complex(ABO complex هم انجام میشه که در اون بیوتین انتی بادی ثانویه با اویدین واکنش میده…
البته باید بدونین چون استرپتواویدین گلیکوزیله نیست در واکنش با بیوتین نسبت به اویدین کمتر اتصالات غیر اختصاصی ایجاد میکنه و دقتش بالاتره…

متد LSAB

متد LSAB

متد ABC

متد ABC

مرحله ی اول در اضافه کردن انتی بادی اولیه انتخاب انتی بادی مناسب با غلظت درست و پروسه انکوبه کردن مناسبه…
اگر بار اولتونه که دارین از یک انتی بادی استفاده میکنین بهتره که حتما یکسری ویژگی ها رو در انتی بادی انتخابیتون ازمایش کنین تا مطمئن بشین که جواب درستی میگیرین…
اولین ویژگی ای که باید در انتی بادی تون بسنجیم میزان اختصاصیت اون به انتی ژن های هدف در بافت نمونه تونه…
چطوری میشه اختصاصیت یک انتی بادی رو سنجید؟؟؟

یکی از روش ها میتونه تست کردن انتی بادی روی بافتی باشه که شما اطمینان دارین که اون بافت پروتئین مورد نظر شما رو بیان نمیکنه… مثل چه بافتی؟؟؟ افرین درسته.. بافتی که بیان اون پروتئین خاص در اون knock out شده باشه…
راه بعدی اینه که اگر شما در تکنیک وسترن با این انتی بادی تونستین باند ببینین میتونین تا حدودی مطمئن بشین که انتی بادیتون اختصاصی عمل میکنه…
راه دیگر استفاده از انتی بادی در بافتیه که شما مطمئن هستین که در جایگاه خاصی از اون پروتئینتون بیان داره..
اگر بخواین خیلی دقیق باشین میتونین ساختار انتی بادی و انتی ژنتون رو با ابزار های بیوانفورماتیکی blast کنین که البته اینکار دیگه خیلی ریزبینانه است
سوال دیگری که باید جوابش رو بدونیم اینه که ایا اصلا این انتی بادی به درد استفاده در تکنیک ایمونوهیستوشیمی میخوره یا نه؟!!!
دقت کنین که همیشه استفاده از انتی بادی ای که در کار وسترن بلات ازش استفاده کردین الزاما در این تست استفاده نمیشه…چرا؟؟؟
چونکه در وستر بلات شما مراحلی دارین که ممکنه ساختار انتی ژنی پروتئینتون رو تغییر بده اما در تکنیک IHC ساختار انتی ژن ها به ساختار طبیعیشون نزدیکتره .. حواستون باشه که ما در این تست با انجام مراحلی چون فیکس کردن بافت و بازارایی انتی ژنی دقت کارمون برای اتصال انتی بادی با انتی ژن هدفمون رو خیلی بالاتر میبریم…

ویژگی بعدی اینه که باید بدونیم که برای کارمون بهتره از انتی بادی مونوکلونال استفاده کنیم یا انتی بادی پلی کلونال؟؟؟
حواستون باشه که انتی بادی های مونوکلونال فقط یک مدل ایزوتوپ در انتی ژن ها رو شناسایی میکنن برای همین احتمال ایجاد cross link با انتی ژن های پروتئین های دیگر در اونها خیلی کمتره..بهمین دلیل background کمتری نسبت به انتی بادی های پلی کلونال ایجاد میکنن.
اما انتی بادی های پلی کلونال چون از یک جمعیت هتروژن گرفته شدن میتونن چندین مدل اپی توپ در انتی ژن ها رو شناسایی کنن .. در این تکنیک این مسئله به چه درد ما میخوره؟؟؟

ببینین با تمام دقتی که این تکنیک در حفظ ساختار انتی ژن ها داره باز هم ممکنه در پروسه های فیکس کردن و یا حرارت دیدن انتی ژن ها تا حدودی confotmation خودشون رو تغییر بدن که در اینحالت استفاده از انتی ژن های پلی کلونال دقت رو بالاتر میبره..
از سوی دیگه تجربه ثابت کرده که انتی بادی های پلی کلونال در شرایط تغییرات PH و غلظت های متغیر نمک و بافر ها نسبت به انتی بادی های مونوکلونال پایداری بیشتری دارن..

ویژگی بعدی در انتخاب انتی بادی مناسب انتخاب اون نسبت به گونه ایه که بافتش رو دارین بررسی میکنین.. دقت کنین که حتما انتی بادی منتخبتون از لحاظ گونه با بافت مورد ازمایشتون تفاوت داشته باشه.. چرا؟؟؟ چون این کار باعث میشه که از هر گونه میانکنش بین انتی بادی با هموگلوبین های درونی بافت مورد ازمایش جلوگیری کنین..

و در نهایت اخرین سوالی که باید بهش جواب بدین اینه که چه مقدار و چه مدت باید انتی بادی تون رو با بافتتون انکوبه کنین…
جواب این سوال خیلی در کیفیت کارتون تاثیر داره.. و من اصلا نمیتونم یک مقدار و زمان مشخص بهتون بدم چون کاملا بستگی به انتی بادی و بافت مورد ازمایش شما داره…
برای جواب دادن به این سوال که چه مقدار انتی بادی باید استفاده کنین شما باید از تیتراسیون انتی بادی کمک بگیرین یعنی یک شیب غلظتی از انتی بادی با بافری که باید انتی بادی رو در اون حل کنین ( در datasheet انتی بادیتون نوشته) درست کنین و با انجام ازمایش روی بافتی که مطمئن هستین انتی ژن مورد هدفتون رو داره تیتر مناسب انتی بادی رو بدست بیارین..

برای اینکه بدونین چه مدت و در چه دمایی باید انتی بادی رو با بافتتون انکوبه کنین باید چندین بار این ازمایش رو با بافت کنترل مثبتتون انجام بدین… اما اینوبدونین که تجربه ثابت کرده که زمان انکوباسیون بالا با دمای پایین میتونه دقت کارتون رو افزایش بده…
بازم میگم این مسئله کاملا بستگی به انتی بادی و بافتتون داره البته در datasheet انتی بادی ای که استفاده میکنین عموما دما و مدت لازم نوشته شده…

حالا بیان پروتکل اضافه کردن انتی بادی رو با هم مرور کنیم:
شما بعد از اینکه از مواد بلاک کننده استفاده کردین باید slide تون رو با PBSسرد به مدت تقریبا ۵ دقیقه بشورین ( حواستون باشه به هیچ عنوان به سطح slide دست نزنین)
بعدش مقدار مشخصی از انتی بادی رقیق شده ( عموما در TBS با ۱% BSA حل میکنن اما بازم به datasheet انتی بادیتون مراجعه کنین) رو قطره قطره به تمام نواح بافت فیکس شده بر روی slide بریزین… حالا با توجه به مدت زمان انکوباسیون و دمای لازم بافت رو با انتی بادی انکوبه کنین…
مدت زمان انکوباسیون از یک ساعت تا یک overnght متغیره دما هم میتونه از ۳۷درجه تا ۴ درجه فرق داشته باشه ( باز هم میگم هم datasheet انتی بادیتون رو بخونین و هم با تست کردن روی بافت کنترل مثبت این دما و زمان رو محاسبه کنین)
بعد از اتمام زمان انکوباسیون اسلاید رو با PBS سرد به مدت تقریبا ۵ دقیقه بشورین..

بعد از این مرحله اگر از روش مستقیم استفاده کردین باید سوبسترای مربوط به انزیم متصل به انتی بادیتون رو اضافه کنین اما اگر میخواین از روش غیر مستقیم استفاده کنین الان باید مقدار مشخصی از انتی بادی ثانویه تون رو قطره قطره با اسلایدتون اضافه کنین…
یک نکته که باید در استفاده از انتی بادی ثانویه بهش دقت کنین اینه که در اینجا هم شما باید از یک کنترل منفی استفاده کنین.. یعنی چی؟؟ یعنی بیاین ابتدا بافری بدون انتی بادی اولیه به بافتتون بزنین و بعدش انتی بادی ثانویه رو بریزین در اینصورت اگر لکه ببینین نشون میده که انتی بادی ثانویه تون اختصاصی عمل نمیکنه)
برای دقت بیشتر میتونین از کنترل های دیگر برای تعیین اختصاصیت و دقت انتی بادی ثانویه استفاده کنین مثل isotype matched controls برای انتی بادی های مونوکلونال و یا بررسی اختصاصیت انتی بادی ثانویه بر اساس بافت هدفتون…

یک احتمال خطای دیگه در حین کار با انتی بادی ثانویه میتونه احتمال میانکنش اون با ایمونوگلوبین های بافت مورد هدفتون باشه . برای رفع این مشکل شما بهتره که قبل از اضافه کردن انتی بادی ثانویه تون ابتدا بافت رو با سرمی که از گونه ی انتی بادی ثانویه تون گرفته شده انکوبه کنین .. اینکار باعث میشه که نواحی Fc رسپتور هایی که در بافت ممکنه اتصال غیر اختصاصی ایجاد کنن کم بشه…
از سوی دیگه حواستون باشه که گونه هایی که انتی بادی اولیه و ثانویه از اونها گرفته شده با هم فرق داشته باشه..

خوب وقتی که مطمئن شدین انتی بادی ثانویه تون اختصاصی کار میکنه و فقط به انتی بادی اولیه تون متصل میشه حالا وقت اونه که مقدار مناسبی از انتی بادی ثانویه تون رو در دما و زمان بهینه ( در datasheet انتی بادی نوشته شده) به نمام نواحی اسلایدتون قطره قطره اضافه و اسلایدتون رو در دما ی مناسب انکوبه کنین..
بعدش مجددا اسلاید رو با PBS و یا tritonX100 بشورین…
یک نکته ی مهم که باید بهتون اینه که اگر اسلاید هاتون رو بعد از اضافه کردن انتی بادی ها با ۰٫۰۲۵% Triton X-100 همراه با TBS بشورین باعث میشه که شکنندگی بافت روی اسلاید کم بشه و این حالت سبب پوشده شدن بهتر اسلاید با انتی بادی ها میشه از سوی دیگه این بافر باعث حل شدن نواحی Fc رسپتور در بافت میشه که اختصاصیت انتی بادیتون رو بالا میبره و اینجوری از ایجاد لکه های غیر اختصاصی جلوگیری میشه..

خوب خسته نباشین ما تا الان نحوه ی کار وبهینه سازی استفاده از انتی بادی های اولیه و ثانویه رو یاد گرفتیم. پروتکل انجام کار رو هم بلد شدیم…

حالا وارد مرحله ی شناسایی میشیم… این مرحله کاملا بستگی به نوع انتی بادی ثانویه ی شما داره.. ار انتی بادی ثانویه تون بر مبنای اتصال انزیم و سوبسترا طراحی شده مثل انتی بادی ثانویه ای که به ان انزین HRP »تصله شما باید مقدار مشخصی سوبسترای DAB به اسلایدتون اضافه کنین و اون رو در دمای اتاق به مدت لازم که سوبسترا حسابی به خورد اسلاید بره قرار بدین …

اما اگر از انتی بادی های ثانویه ای استفاده میکنین که فلوروکروم بهشون متصلهدیگه لازم نیست از سوبسترا استفاده کنین فقط باید بعد از مرحله ی اضافه کردن انتی بادی ثانویه اسلاید رو دور از نور قرار بدین.. این نشانگر ها وقتی نوری با طول موج معین برانگیخنه میشن از خودشون نوری با طول موج بالاتر ساطع میکنن و عموما برای شناسایی چندین انتی ژن بصورت همزمان کاربرد دارن..

انواع انزیم هایی که میتونن به انتی بادی های ثانویه متصل بشن با سوبستراهاشون همراه با مزایا و معایبشون در جدول زیر اورده شده..

مرحله ی بعدی مرحله ی countestaining است.

اما قبل از توضیح این مرحله کمی در مورد استفاده از نشانگر های فلورسنتی با هم صحبت کنیم.

دوستان امروزه استفاده از نشانگر های فلورسنتی در تکنیک های ایمونوخیلی رایجه… فلوفور های متعددی وجود داره که میتونن به انتی بادی های اولیه و ثانویه متصل بشن و به عنوان نشانگر های بافتی ازشون استفاده بشه..
استفاده از انتی بادی های متصل به فلوروکروم ها در ازمایشاتی که میخواین در یک زمان چندین انتی ژن رو شناسایی کنین خیلی کاربرد داره…
شکل زیر مجموعه ای از انواع فلوروکروم رو بهتون نشون میده…

انواع فلوروکروم

اما ازمایشاتی که میخواین در یک زمان چندین انتی ژن متفاوت رو با هم بررسی کنین چند تا نکته است که برای بالا بردن کیفیت کارتون باید بهش دقت کنین…
۱- باید حواستون باشه که از فلوروکروم هایی استفاده کنین که رنگ هاشون زیر میکروسکوپ فلورسنت خیلی با هم فرق داشته باشه بتونین هر گروه انتی ژنی رو از گروه دیگه براحتی تشخیص بدین…
۲- اگر از حالت غیر مستقیم برای اتصال انتی ژن- انتی بادی استفاده میکنین باید دقت کنین که انتی بادی های اولیه و ثانویه به صورت اشتباهی با هم واکنش ندن…
برای حل این مشکل باید انتی بادی اولیه ای که برای هر انتی ژن انتخاب میکنین از یک گونه ی خاص باشه ( منظورم اینه که گونه هایی که انتی بادی های اولیه تون رو ازش میگیرین با هم فرق داشته باشه) اینطوری مطمئن میشین که هر انتی بادی ثانویه فقط به انتی بادی اولیه ی مربوط به خودش متصل میشه…

اگر هم امکان استفاده از انتی بادی های اولیه گرفته شده از گونه های مختلف رو ندارین در اینصورت باید یکی از انتی بادی های اولیه تون biotinylate شده باشه…
در اینصورت شما باید ایتدا بافتتون رو با انتی بادی های غیر بیوتینیله انکوبه کنین و بعدش انتی بادی ثانویه ی متصل به فلوروکروم اون رو اضافه کنین… سپس بافت رو با انتی بادی های اولیه بیوتینیله انکوبه کنین و بعدش انتی بادی های ثانویه ی حاوی استرپتواویدین که فلوروکروم بهشون متصل هست رو اضافه کنین…
البته در این حالت بهتره قبلش حتما از بلاک کننده های بیوتین درونی بافت استفاده کنین تا لکه های غیر اختصاصی نبینین… از طرفی سعی کنین در این حالت از بافت های منجمد استفاده نکنین..

بعد از مرحله ی اضافه کردن سوبسترای مربوط به انزیم متصل به انتی بادی ثانویه و یا اضافه کردن انتی بادی های متصل به فلوروکروم به بافت شما باید counterstaining  انجام بدین…
حالا اصلا counterstaining یعنی چی؟؟؟؟
ببینین دوستان counterstainig به معنای رنگ امیزی سلول های بافتتتون است… شما با اینکار میاین به تضاد رنگی بین محل هایی که پروتئین مورد هدفتون در اونجاست با سایر نقاط بافت ایجاد میکنین اینجوری خیلی راحت تر میتونین متوجه بشین که دقیقا پروتئین هدفتون در کجای سلول و بافت قرار داره…
رنگ امیزی سلول های بافت به شما این امکان میده که مرفولوژی سلول و بافتتون رو بشناسین و متوجه بشین که پروتئین هدفتون دقیقا در کجای سلول قرار گرفته…
در شکل زیر بخوبی دلیل رنگ امیزی سلولهای بافت رو متوجه میشین.. به تضاد رنگی دقت کنین.. در این شکل انتی ژن های هدف با رنگ فلورسنت سبز نشاندار و هسته های سلول با رنگ فلورسنت ابی رنگ شده اند..

counterstaining

ک نکته هست که باید برای رنگ امیزی سلول های بافت بهش دقت کنین و اون هم اینه که زنگی که انتخاب میکنین با رنگ فلورسنتی که انتی ژن ها رو میخواین باهاش نشاندار کنین خیلی فرق داشته باشه تا این تضاد بخوبی نشون داده بشه..
مثلا اگر از یک فلوروفور قرمز برای نشاندار کردن انتی ژنتون استفاده میکنین رنگی که میخواین باهاش سلولتون رو رنگ امیزی کنین ابی باشه…
انواع مختلف رنگ برای رنگ امیزی سلول های بافت وجود داره که میتونه ماهیت chromogenic و یا fluorescent داشته باشه…
در زیر با انواع این رنگ ها اشنا میشم…

انواع رنگ های chromogenic

انواع رنگ های chromogenic

انواع رنگ های fluorescent

انواع رنگ های fluorescent

اینکه کدام رنگ را برای کارتون انتخاب کنین بستگی به بودجه و امکانات ازمایشگاهتون داره…
از رایج ترین رنگ های کروموژنیک در این تکنیک هماتوکسیلین و از رایج ترین رنگ های فلورسنتی DAPI میباشد…
رنگ DAPI به DNA موجود در هسته متصل میشه و رو به رنگ ابی هسته در میاره..
رنگ Hoest هم از دیگر رنگ های فلورسنتی رایجه که به DNA موجود در هسته متصل میشه و هسته ی سلول رو به رنگ ابی در میاره…

حالا که هر دو تا رنگ های DAPI و Hoest هسته ی سلول رو به رنگ ابی در مارن بنظرتون تفاوت بیا دو رنگ در چیه؟؟؟
۱- رنگ Hoest سمی زایی کمتری نسبت به DAPI دارد.
۲- گروه اتیل موجود در ساختار رنگ Hoest باعث میشه که این رنگ راحتر از غشای سلول عبور کنه.
۳- هر دو رنگ ذکر شده میتونن هسته ی هم سلول های زنده و هم سلول های FIXشده رو رنگ امیزی کنن اما کارایی رنگ Hoest در عبور از غشای سلول های زنده بیشتر از رنگ DAPI است برای همین از رنگ DAPI برای رنگ امیزی سلول های زنده استفاده نمیشه.

خوب دوستان پروتکل اضافه کردن رنگ در این مرحله بسته به اینکه از کدام ماه ی رنگی استفاده می کنین متفاوته .. و بسته به شرایط کارتون خودتون باید زمان و میزان اضافه کردن ماده ی رنگی رو set up کنین..
اما عموما زمانی که باید اسلاید بافت در هماتوکسیلین قرار بگیره بین ۲ تا ۳ دیقه است و برای رنگ DAPI در حدود ۲ تا ۵ دقیقه در دمای اتاق…
فقط یادتون باشه که بعد از این مدت اسلاید رو با PBS و یا اب استریل به مدت حداکثر ۱۰ دقیقه بشورین (مقدار شستشو بستگس به نوع رنگ و کیفیت اون داره)…

در شکل زیر بافت غدد شیری رو در مراحل مختلف سرطانی نشون داده شده که در اون هسته ی سلول ها با هماتوکسیلین رنگ شدن ( رنگ ابی) و انتی ژن ها به دلیل واکنش DAB و انزیم HPR به رنگ قهوه ای در اومدن.

اگر بخوایم یک دوره ی کوتاه از کار هایی که تا به امروز کردیم رو با هم بررسی کنیم باید بگیم ما تا الان:
۱- بافتمون رو پارافینه و فیکس کردیم.
۲- بعد از هیدراته کردن بافت ، بازارایی انتی ژنی انجام دادیم.
۳- بعدش انتی ژن های غیر اختصاصیمون رو بر اساس نوع نشاندار کردنمون بلاک کردیم.
۴- انتی ژن های اولیه و ثانویه مون رو اضافه کردیم.
۵- در صورت استفاده از نشانگر های انزیمی به بافتمون سوبسترا اضافه کردیم.
۶- و در نهایت برای ایجاد تضاد رنگی بین جایگاه انتی ژن های موردن نظرمون با سایر نواحی سلول در بافت سلول ها رو رنگ امیزی کردیم…


خوب حالا میرسیم به اخرین مرحله ی کار قبل از مشاهده زیر میکروسکوپ که اسمش هست مرحله ی mounting….

خوب اصلا میدونین mounting یعنی چی؟؟؟
اگر معنی این واژه رو بدونین این مرحله راحت تر یادتون میمونه… mounting به معنای محکم کردن و محافظت کردنه….
ما در این مرحله قصد داریم تا اتصال اسلاید و coverslip رو محکم کنیم….
اما چرا؟؟؟؟
ببینین این انجام این مرحله برای حفظ نمونه مون برای مدت طولانی و همچنین بهتر کردن کیفیت عکسی که در انتها زیر میکروسکوپ میگیریم خیلی مفید و ضروریه…
اگر این مرحله رو درست انجام بدین در انتها عکستون و لکه هایی که میبینین خیلی واضح میشن و contrast کمتری خواهید داشت..
پس همونطور که گفتیم ما قصد داریم در این مرحله اتصال و چسبندگی coverslip و صفحه ی اسلایدمون که بافت روی اون فیکس شده رو بیشتر کنیم…
فقط قبلش باید یک کار مهم انجام بدیم و اونهم ابگیری از بافتمونه….
چرا؟؟؟ اگر یادتون باشه ما یکبار قبلا از بعد از پارافینه کردن بافتمون اون رو ابگیری کردیم تا بتونیم بافت رو با پارافین فیکس کنیم بعدشم ابدهی کردیم تا پارافین حذف بشه و بتونیم مراحل اصلی کار رو انجام بدیم حالا الان چرا باید دوباره بافت رو ابگیری کنیم؟؟؟
ببینین دوستان همونطور که گفتم هدف از این مرحله محکم کردن اتصال بین اسلاید و coverslip هستش… یعنی بافت کاملا بین این دو صفحه فیکس و پرس میشه … حالا تصور کنین که داخل بافت اب باشه … بنظرتون چه ایرادی داره؟؟؟ افرین… اب اضافی باعث ایجاد حباب بین اسلاید و coverslip میشه و حباب کیفیت کارمون رو خیلیییییی پایین میاره ( درست مثل وسترن بلات) پس ما باید قبل از مرحله ی mounting حتما بافت رو ابگیری کنیم تا از ایجاد حباب بین اسلاید و coverslip جلوگیری بشه….
ابگیری یعنی قرار دادن اسلاید بافتمون در یک شیب غلظتی الکل از غلظت کم به زیاد…در نهایت هم با xylene بافتتون رو بشورین..دقت کنین که مدت زمان ها بستگی به بافتتون داره و همیشه یکسان نیست.

آبگیریخوب حالا که بافتمون رو ابگیری کردیم میریم سراغ mounting کردن اسلاید و coverslip مون…

برای انجام این کار ما دو نوع محیط مختلف داریم که یکی از اینها محیط organic و محیط aqueous.
محیط organic یک محیط ابگریزه که برای حالت هایی بیشتر استفاده میشه که شما از نشانگر های انزیمی استفاده میکنین…
چرا؟؟؟؟ چونکه رسوبات تشکیل شده به واسطه ی واکنش بین انزیم و سوبسترا در محیط های organic حل نمیشن…
محیط های aqueous ابدوست هستند و در هر شرایطی چه استفاده از نشانگر های انزیمی و چه استفاده از نشانگر های فلورسنتی قابلیت استفاده دارند.

مرحله ی Mounting

مرحله ی Mounting

خوب حالا که این مرحله رو متوجه شدین چند تا نکته هست که باید بهتون بگم..
۱- محیط های Mounting برای نشانگر های انزیمی و فلورسنتی با هم فرق دارن پس بهتره قبل از تهیه از نوع نشاندار کردنتون مطمئن بشین.
۲- حواستون باشه که محیط Aqueous-mounting mediaای که استفاده میکنین حتما شفاف باشه.. هر گونه کدر بودن نشاندهنده ی الودگی قارچی و باکتریایی در محیطتونه که کارتون رو خراب میکنه.. برای همین بهتره محیطتون حتما باید شامل مواد bacteriostatic باشه.
۳- دقت کنین که اگر چه محیط های organic برای نشانگر های کروموژنیک مناسب هستند اما بعضی وقت ها بعضی رسوبات انزیم و سوبسترا در محیط های organic حل میشن برای همین اگر به حل نشدن رسوب در محیط organic مطمئن نیستین بهتره از محیط های Aqueous استفاده کنین.

۴- دقت کنین بعد از این مرحله اسلایدتون رو در تاریکی نگه دارین تا لکه های تون fade نشن..
۵- برای جلوگیری از محو شدن لکه ها از روی اسلاید بهتره از مواد anti-fade استفاده کنین.. البته محیط های Mounting خودشون شامل antifade هستن.. فقط شما باید مطمئن بشین که فلوروفوری که استفاده کردین با ماده ی anti-fade تون شازگار باشه… برای همین حتما قبل از شروع کار از مناسب بودن محیطی که انتخاب کردین مطمئن بشن…
خوب دوستان عزیز خسته نباشین این هم از اخرین مرحله ی تکنیک ایمونوهیستوشیمی که با هم بررسیش کردین…

بعد از انجام mounting باید اسلایدتون رو در حدود یک overnight در دمای اتاق نگهدارین تا خشک بشه و بعدش با میکروسکوپ فلورسنت ببینین…
یه موضوع دیگه شما میتونین اسلایدتون رو بعد از Mounting تا مدتها نگهدارین چون با Mount کردن بافتتون رو از اسیب های فیزیکی محافظت میکنه…

ما با هم تکنیک ایمونوهیستوشیمی رو تموم کردیم..شما دیگه به تک تک مراحل انجام کار، موادی که استفاده میشه و دلیل انجام هر مرحله کاملا مسلط هستین… پس الان هر سوالی که ازتون راجع به این تکنیک بپرسن میتونین جواب بدین…

اما حالا یه سوال ازتون دارم.شما میدونین چه مدل کنترل هایی برای این تکنیکک باید استفاده بشه؟؟؟
همونطور که اکثرمون میدونیم استفاده از کنترل برای مطمئن شدن از درست انجام دادن کاره…
در تکنیک ایمونوهیستوشیمی ما دو مدل کنترل باید داشته باشیم…
۱- کنترل های مربوط به بافت که بهش Antigen Control هم میگن…
۲- کنترل های مربوط به مواد که بهش Reagent controlsهم میگن…

فکر کنم الان همتون کنترل های مربوط به بافت و یا انتی ژن رو بشناسین…
کنترل های مثبت در این مدل بافت هایی هستن که ما مطمئن هستیم پروتئین مورد نظر ما رو بیان میکنن. از این کنترل برای set up کردن مراحل کارمون استفاده میکنیم..

کنترل های منفی ، کنترل هایی هستن که اصلا انتی ژن مورد نظر ما رو بیان نمیکنن( میتونن بافت هایی باشن که انتی ژن مورد نظر ما در اونها knock-out شده) . از این کنترل ها برای بررسی اتصالات غیر اختصاصی و یا جواب های false-possitive استفاده میکینیم.

و در نهایت کنترل های مربوط به endogenous فلورسنت ها.. در این حالت قبل از شروع کار شما بافتتون رو زیر میکروسکوپ میبینین تا اگر بصورت خودمختار نور فلورسنت از خودش ساطع میکنه در کار شما جواب های false-possitive ایجاد نشه…

کنترل های بر پایه ی بررسی کیفیت reagent ها به سه دسته تقسیم میشن..
دسته ی اول No primary antibody control ها هستن…
برای داشتن این کنترل ها شما باید بافتتون رو بدون انکوبه کردن با انتی بادی اولیه ، با انتی بادی ثانویه انکوبه کنین..
چرا؟؟؟اینکار چه نفعی برای ما داره؟؟؟
ببینین دوستان این مدل کنترل شما رو مطمئن میکنه که اگر در این کنترل لکه ای دیدین صرفا و صرفا بدلیل میانکنش بین انتی بادی ثانویه با انتی ژن های بافتیتون هستش.. یعنی انتی بادی ثانویه ی شما به صورت غیر اختصاصی با سیستم های شناسایی درون بافتتون واکنش داده ( مثل میانکنش با مواد فلورسانت طبیعی موجود در بافت و یا اتصال با بیوتین ها و یا انزیم های endogenous موجود در بافتتون)
دسته ی دوم کنترل ها Isotype control ها هستند…
اصلا isotype control یعنی چی؟؟؟ isotype control ها همون انتی بادی های اولیه ی شما هستن با این تفاوت که اختصاصیتشون به انتی ژن مورد هدف شما کمه و یا اصلا به انتی ژن مورد هدف شما متصل نمیشن… اما از لحاظ کلاس و نوع انتی بادی کاملا مطابق با انتی بادی اولیه ی شما هستن…
حالا اصلا استفاده از این انتی بادی ها چه فایده ای داره؟؟؟

این مدل انتی بادی ها به عنوان کنترل های منفی به کار میرن… ار شما هرگونه لکه ای در بافتتون به واسطه ی استفاده از این انتی بادی ها مشاهده کردین مطمئن میشین که به دلیل میانکنش های غیر اختصاصی بوجود اومده پس بهتون کمک میکنه که در اسلاید اصلیتون بتونین سیگنال های اختصاصی رو از غیر اختصاصی تشخیص بدین..
دو تا مطلب درباره ی این مدل کنترل ها باید بدونین:
۱- انتی بادی ای که به عنوان isotype control تهیه میکنین دقیقا باید مشابه انتی بادی اولیه تون باشه ( از لحاظ زنجیره های سبک و … ) و فقط باید اختصاصیتی به انتی ژن هدف ما نداشته باشه..
۲- نشاندار بودنش باید عینا مشابه انتی بادی اولیه ی شما باشه تا بتونین ازش به عنوان کنترل استفاده کنین.
۳- این مدل کنترل ها وقتی از انتی بادی های اولیه ی مونوکلونال استفاده میکنین خیلی بدردتون میخوره چون هنگام استفاده ار انتی بادی های مونوکلونال ممکنه باند های غیر اختصاصی رو با لکه های اختصاصی اشتباه بگبرین..

شباهت ها و تفاوت های بین انتی بادی اولیه با isotype control

شباهت ها و تفاوت های بین انتی بادی اولیه با isotype control

و در نهایت سومین دسته ی کنترل ها Absorption control ها هستن.
حتما الان میپرسین Absorption control ها چی هستن؟؟
این ها همون انتی بادی های اولیه ی شما هستند که به مدت یک شبانه روز در دمای ۴ درجه با مخلوطی از انتی ژن های هدفتون (حدودا ۱۰ برابر) انکوبه شدن.. حالا تمام جایگاه های اتصال این انتی بادی گرفته شده… پس اگر شما این pre-absorbed antibody روبه بافت هدفتون بزنین باید انتظار داشته باشین که هیچ لکه ای نبینین چون هر لکه ای که در این کنترل ببینین یعنی انتی بادی شما اتصال غیر اختصاصی با انتی ژن ها برقرار کرده…
حالا میتونین این کنترلتون رو که قاعدتا نباید لکه ای داشته باشه با نمونه ی اصلیتون که بهش انتی بادی اولیه زدین مقایسه کنین. با مقایسه ی لکه ها میتونین اتصالات اختصاصی رو از غیر اختصاصی در اسلاید اصلیتون شناسایی کنین…
یک نکته ی دیگه که باید حواستون بهش باشه اینه که استفاده از این مدل کنترل وقتی که ایمونوژنتون پپتید باشه خیلی بهتر از وقتی که ایمونوژنتون پروتئین باشه کار میکنه..
چرا؟؟؟ چون خود پروتئین های متصل به انتی بادی میتونن با بافت میانکنش بدن و background زیادی ایجاد کنن اونوقت شما نمیتونین مقایسه ی خوبی بین کنترل و نمونه تون داشته باشین.

Absorption control

در شکل های بالا بافت dorsal ganglion رت لکه گذاری شده… در شکل سمت راست از انتی بادی های pre-absorbed به عنوان کنترل استفاده شده ببینین در جایگاه های انتی ژنی هدف هیچ لکه ای نمیبینین حالا با مقایسه ی نمونه ی اصلی که ار انتی بادی های اولیه استفاده شده با نمونه ی کنترلی سمت راست میتونین مطمئن باشین که لکه های مشاهده شده در اسلاید اصلی (سمت چپی) درست و ناشی از میاننش های اختصاصی انتی بادی -انتی ژن هدفتون هستن…
خوب دوستان همراه هم مبحث IHC با بررسی انواع کنترل هاش تموم شدن.. دیگه مطلبی در مورد این تکنیک نیست که شما بلد نباشین. باز هم اگر سوالی داشتین در قسمت دیدگاه بنویسین که من در اولین فرصت پاسخ بدم.

برای اینکه به troubleshooting این تکنیک هم مسلط بشین پیشنهاد می کنم به صفحه ی troubleshooting های تکنیک ایمونوهیستوشیمی مراجعه کنیندر اونجا انواع خطاهای محتمل در این تکنیک با راه حل های رفع آن گذاشته شده.

موفق باشید.

print
Tags: , , , , , ,


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

شانزده + هفت =