microRNA Sequencing

با گسترش دانش امروز در زمینه ی ارتباط تنگاتنگ بین عوامل موثر در بیان ژن ها و فنوتیپ بیماری ها مطالعه ی عوامل تنظیمی بیان ژن به مراتب از اهمیت بیشتری نسبت به بررسی ژن ها به تنهایی برخوردار است.
با مطالعه ژنتیکی در روند ایجاد بیماری ها به این واقعیت می رسیم که بررسی و شناسایی عواملی که به نوعی نقش تنظیمی و کنترل کننده را در بیان ژن ها ایفا میکنند پاسخگوی بسیاری از ابهاماتی هستند که در مطالعه ی مسیر های مولکولی دخیل در بیماری ها با ان مواجه هستیم.
با توجه به اهمیت مولکول های تنظیم کننده بیان ژن ها امروزه بررسی پروفایل های تنظیمی به مراتب اهمیت بیشتری در قیاس با پروفایل های بیانی دارد. از سوی دیگر بررسی پروفایل های تنظیمی راهکاری هوشمند و کم خطر برای درمان ژنتیکی بسیاری از بیماری ها می باشد.
microRNA ها از نخستین مولکول های تنظیمی شناخته شده در سطح بیان ژن ها هستند و در طی تکامل تدریجی به میزان زیادی حفظ شده اند. miRNA ها RNA هایی کوتاه در سیتوپلاسم سلول با طول معادل ۲۱ تا ۲۲ نوکلئوتید هستند که پروسه ی بیان مجموعه های انتخابی از ژن های هدف را از طریق جفت شدن با رونوشت های انها بوسیله ی اتصالات هیدروژنی بین باز های مکمل تنظیم میکنند.معمولا جایگاه های اتصال در ناحیه ی ترجمه نشده ی انتهای ۳’UTR توالی های m RNA هدف قرار داشته و miRNA متصل شده در این جایگاه از عمل ترجمه جلوگیری نموده و از این طریق بیان ژن هدف را در سطح پایین تری تنظیم میکند.چنانچه توالی مکمل miRNA و mRNA با یکدیگر همولوژی بالایی داشته باشند اتصال انها به یکدیگر سبب شکست mRNA هدف و تجزیه ی آن می شود.

نحوه ی سنتز و عملکرد miRNA

نحوه ی سنتز و عملکرد miRNA

 با توجه به تنوع بالای miRNA ها و نقش مهم تنظیمی انها امروزه از این مولکول های کوچک به عنوان biomarker های تشخیصی و یا پیش اگهی برای بسیاری از بیماری ها از جمله سرطان و یا بیماری های عصبی یاد میشود. از این رو مطالعه و شناخت انها در بررسی پروسه های ایجاد بیماری و کشف راهکار های درمانی بسیار سودمند می باشد.

                                                                                                         

بررسی تغییرات بیان این مولکول های کوچک تنظیمی با در نظر گرفتن تاثیراتی که در بیان ژن های متعدد دارند از اولویت های مطالعاتی در زمینه ی بررسی ژنتیکی بیماری ها می باشد. در گذشته از تکنیک هایی همچونReal Time با استفاده از پرایمر و microarray همراه با استفاده از پروب ها  به ترتیب برای سنجش کمی بیان miRNA ها در مقیاس کوچک و سنجش کیفی بیان miRNA ها در مقیاس بزرگ استفاده میشد ؛ حال انکه امروزه  با گسترش علم و افزایش ابهامات ناشی از شناخت ناکافی از این مجموعه ی تنظیمی نیاز به یک بررسی جامع و کامل برای شناسایی تمام  miRNA های دخیل در مسیر های مولکولی تحت تاثیر بروز اختلالات می باشد از این رو استفاده از تکنیک هایی چون microarray که نیاز به دانش  قبلی برای miRNA های تحت بررسی دارد نمیتواند پاسخگوی بسیاری از پرسش ها و کشف بیو مارکر های جدید برای تشخیص اختلالات متعدد باشد.

با توجه به نقش موثر mir ها به عنوان مارکر های تشخیصی و درمانی شناسایی و کشف دامنه ی وسیعی از انها کمک شایانی به رفع بسیاری از ابهامات چگونگی ایجاد بیماری و راهکار های درمانی انها می کند.

با روی کار امدن متد های Next Generation Sequencing امکانی فراهم شد تا بتوانیم بدون نیاز به دارا بودن شناخت قبلی از miRNA ها برای  طراحی    پرایمر و یا پروب ، تمامی miRNA های تغییر یافته در سطح ژنوم را در مواجهه با بروز اختلال و بیماری شناسایی کنیم. با کمک این تکنیک امکان کشف miRNA های جدید و بررسی کمی تغییرات بیان تمامی mir ها در کنار طراحی شبکه های تنظیمی موثر در بروز اختلالات برای محقق  فراهم می شود از سوی دیگر با توجه به حساسیت و هوشمندی بالای این روش حتی mir هایی که در پروسه ی ایجاد اختلال تغییرات اندک و ناچیزی داشته اند شناسایی و تغییرات بیان انها به صورت کمی گزارش می شود. با توجه به دقت بالای این روش در مقایسه با تکنیک هایی چون  microarray شناسایی تغییرات هر چند ناچیز در بیان mir ها در کنار کشف mir های جدید میسر میشود.
مراحل انجام mirseq به سه مرحله تقسیم می شود.
مرحله ی اول مرحله ی اماده سازی کتابخانه است که شامل اماده سازی نمونه ها ، استخراج Mir ها به کمک کیت های مخصوص و بررسی کیفیت آنها ، جداسازی بر اساس سایز ، اتصال اداپتور و در نهایت سنتز cDNA می باشد.
مرحله دوم تولی یابی به کمک دستگاه های مربوطه است.
مرحله ی سوم انالیز و تحلیل داده های خام حاصل از توالی یابی به کمک دانش بیوانفورماتیک می باشد.

مرحله اماده سازی کتابخانه ها و انجام تولی یابی

انالیز داده ها mirseq                                                                                 آنالیز داده ها mirseq

لازم به ذکر است انچه که توسط محقق انجام می شود صرفا اماده سازی نمونه ها و استخراج miRNA ها به کمک کیت های مخصوص می باشد  بقیه ی مراحل تا انتهای توالی یابی توسط شرکت های مربوطه انجام گرفته و داده های خام پس از توالی یابی برای انالیز و تحلیل به محقق تحویل داده میشود.

مزایای انجام mirseq
۱- مطالعه ی نحوه ی مشارکت مولکول های کوچک تنظیمی در پروسه ی بیان ژن ها
۲- شناسایی طیف وسیعی از RNA های کوچک و miRNA ها
۳- امکان اندازه گیری کمی بیان انواع mir هایی که در پروسه ی بروز اختلال دچار تغییرات اندک شده اند
۴- کشف انواع mir های ناشناخته
۵- کشف بیومارکر های تشخیصی و درمانی برای بسیاری از بیماری ها
۶- امکان شناسایی شبکه های عظیم تنظیمی در مسیر های مهم و تاثیرگذار مولکولی
۷- شناسایی الگو های بیانی مختص به بافت
۸- کشف انواع ایزوفرم های mir ها و بررسی تاثیرات هر کدام در پروسه های تنظیمی به صورت جداگانه
۹- امکان انجام بر روی هر گونه ی ناشناخته بدون در نیاز به توالی تنظیمی مرجع

جهت آشنایی بیشتر با آنالیز داده های mirseq، اینجا را کلیک کنید. 

print
Tags: , , , , ,


۱ دیدگاه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

19 + 9 =