Methylomics

 
مقدمه : میتلاسیون DNA که شکل اصلی از تغییرات اپی ژنتیکی می باشد که نقش اساسی در روند ایجاد بیماری و یا فیزیولوژی دارد. در ژنوم انسان در حدود ۸۰ درصد سیتوزین های ۵۶ میلیون ناحیه CPG متیله هستند و به ۵ متیل سیتوزین تبدیل شده اند.
الگوی میتلاسیون DNA در بین انواع سلول ها و درجات مختلف تکامل متغیر می باشد که یکی از عوامل تاثیرگذار در روند ایجاد بیماری است. تکنیک های آنالیز در راستای تشخیص این نواحی و جایگاه یابی آنها تکامل پیدا کرده اند.
به طور متناوب ولی نه اختصاصی دی نوکلئوتید CPG در نواحی پراکنده جزایر CPG وجود دارد که این نواحی عموماً در ناحیه کنترلی ژن مثل پروموتر در مقایسه ی با سایر نواحی مثل اینترون واگزون ها وجود دارد.

                                                                                        methylomics

Methylomics

فاکتورهای اصلی که برای انتخاب تکنیک درست آنالیز میتلاسیون باید در نظر گرفته شود:
– هدف از مطالعه : کشف متیلاسیون denovo یا بررسی نواحی میتلاسیون شناخته شده در نواحی ژنومی مورد نظر.
– مقدار و کیفیت نمونه ی DNA
– میزان حساسیت و دقت مورد نیاز مطالعه
– قدرت و سادگی تکنیک
– نرم افزارهای بیوانفورماتیکی در دسترس برای آنالیز و تفسیر اطلاعات
– reagent و تجهیزات اختصاصی در دسترس
– هزینه مصرفی

استراتژی های اصلی برای کشف و validation بیومارکرهای مربوط به میتلاسیون :
– هضم با آنزیم محدود کننده
– آنالیز برپایه وابستگی (Affinity)
– تغییرات با Bisulfite
ترکیب سه استراتژی بالا همراه با توالی یابی و microarray راهکارهای متعددی برای آنالیز میتلاسیون DNA را فراهم می کند.

  تاریخچه ی متیلومیکس

                                                                                   تاریخچه ی متیلومیکس

High density microarray
مزایا:
مدت زمان کم آن
کاهش هزینه نسبت به توالی یابی
آنالیز همزمان تعداد بسیاری از نمونه ها با پوشش گسترده تری از CPG
معایب:
این تکنیک فاقد آنالیز کمی معتبر می باشد که به دلیل محدودیت های طراحی پروب، کارآیی هیبریداسیون و صنوع هیبریداسیون می باشد.

High throughput Sequence:
مزایا:
اطلاعات کمّی درباره ی وضعیت میتلاسیون هر CPG به ما می دهد
امکان آنالیز میتلاسیون را در توالی های تکراری و نواحی کمیاب و جایگاه هایی که امکان آنالیز با میکرواری نیست را ایجاد می کند.
امکان آنالیز شرایط میتلاسیون در نواحی ای از توالی که هیچ شناختی از آن نداریم را نیز به ما می دهد.
معایب:
مهمترین ضعف توالی یابی library bias ، قیمت، میزان در دسترس بودن و مدیریت آنالیز اطلاعات می باشد.

                                                                                                   High throughput Sequence

روش هضم با آنزیم محدود کننده :
این روش با به کارگیری از آنزیم های حساس به میتلاسیون که تنها DNA را در نواحی غیر متیله برش می دهد و آنزیم های وابسته به میتلاسیون که DNA را در نواحی متیله برش می دهد.
HpaII وMspI  ایزوشیتزومر که نواحی شناسایی و برش یکسان است اما CPG HpaII های متیله را برش نمی دهد.
SmaI وXmaI  نئوشیتزومر که نواحی شناسایی یکسان و برش متفاوت دارد. SmaI نواحی CPG غیر متیله را برش می دهد.

                                                                                                           روش هضم با آنزیم محدود کننده :

تکنیک های برپایه هضم آنزیمی:

روش ( HpaII tiny fragment enrichment by ligation-mediated PCR (HELP :
این روش نواحی متیله شده را در ژنوم شناسایی می کند.
روش کار: ابتدا ژنوم ها یکبار با HPAII و یکبار با MSPI برش می خورد. قطعات حاصل شده به روش Ligation mediated PUR تکثیر می شوند. قطعات حاصل از برش HpaII با cys5 و MSPI با cys3 lable گذاری می شود و سپس با پروب های موجود در array هیبرید می شوند.

                                                                                                        HpaII tiny fragment enrichment by ligation-mediated PCR (HELP)

روش (luminometric methylation assay (LUMA :
این روش تلفیقی از هضم آنزیمی و Pyroseqvencing می باشد که روشی حساس و تطبیق پذیر است که امکان مطالعه دقیق میتلاسیون DNA در تعداد زیادی از نمونه ها را ایجاد می کند.
در این روش از آنزیم ECRI به عنوان کنترل داخلی استفاده می شود تا مشکل میزان DNA استفاده شده برطرف شود.
روش کار: با توجه به زواید حاصل از برش HpaII، mspI (GC) و ECORI (AATT) برنامه دستگاه Pyroseqvencing برای افزودن dNTP به محلول واکنش به ترتیب برنامه ریزی می شود:dATP ، مخلوط dCTP +dGTP ،dTTP ، dCTP+dGTP

                                                                                                    luminometric methylation assay (LUMA)

ارتفاع پیک ها به وسیله دستگاه محاسبه و سپس نسبت پیک های مربوط به هر آنزیم به صورت زیر محاسبه می شود:
میتلاسیون سطح=(HPII/ECORI)/(mspI/ECORI)= ((dGTP+dCTP)/dATP)/((dGTP+dCTP)/dATP)
از آن جایی که آنزیم MspI به میتلاسیون GC حساسیتی ندارد بنابراین درهر صورت در جایگاه هدف برش ایجاد می کند. اما آنزیم HPaII در صورت متیله شدن GC برش ایجاد نمی کند پس در صورتی که جایگاه هدف میتله نباشد هر دو آنزیم آن را برش می دهد و نسبت ۱=HPaII/MSPI می شود اما در صورتی که جایگاه هدف میتله باشد HPaII برش ایجاد نمی کند نسبت به مذکور به صفر میل می کند. در موارد دیگر این نسبت بین صفر و یک خواهد بود.
این متد یک متد کمی با قابلیت محاسبه ی راحت می باشد. کل مدت زمان آن ۲h می باشدو مقدار اندکی از DNA نمونه در حدود ۲۰۰-۵۰۰ ng لازم می باشد.

روش (Methylation-Sensitive Cut Counting(MSCC:

این تکنیک برای شناخت مناطق متیله ناشناخته به صورت untargeted است که یک آنالیز کمی میتلاسیون در نواحی CPG کل ژنوم ایجاد می کند. (۴/۱ میلیون CPG در انسان)
روش کار: HPaII DNA را در مناطق غیر متیله برش می دهد و مناطق متیله بدون برش می ماند. به قطعات حاصله ، اولین آداپتور که شامل ناحیه برشی MmeI است اضافه می شود حال MmeI قطعات را برش داده و به قطعات حاصل از برش ، آداپتور دوم اضافه می شود. حال تکثیر رخ داده و توالی یابی می شود. در زیر توالی برش انزیم MmeI قابل مشاهده است.

                                                                                                      Mme1 Recognition Site

تعداد قطعات ایجاد شده برای خواندن در یک ناحیه با مقدار هضم آنزمی که رخ داده ارتباط دارد و نشان دهنده ی سطح میتلاسیون می باشد.

                                                                                                     

روش (Methylation amplification DNA chip(MAD :
روش کار : قطعات DNA حاصل از ۲ نمونه توسط آنزیم SmaI در مناطق غیر متیله برش می خورند سپس آنزیم XmaI این قطعات برش خورده حاوی مناطق متیله را برش می دهد و ایجاد overhang CCGG در مناطق متیله می کند. این قطعات متیله با آداپتور ligate شده و با linker های اضافه شده PCR می شود. Amplicon های حاصل از دو نمونه ، جدا label گذاری شده و در CPG island microarray chip هیبرید می گردند.
این تکنیک به طور همزمان هم سبب کاهش پیچیدگی و هم افزایش اختصاصیت از طریق هدف قرار دادن مناطق CPG متیله قبل از تکثیر می شود.

                                                                                         (Methylation amplification DNA chip)MAD

روش (Comprehensive High-throughput arrays Relative methylation (CHARM :
این تکنیک جای یابی عملکرد میتلاسیون DNA به عنوان مثال محل جزایر CPG یا نواحی پروموتر و نواحی با تراکم کم CPG در ژنوم را به طور واضح نشان می دهد.
روش کار: ابتدا DNA توسط آنزیم RE ای مثل MseI برش می خورد. سایت شناسایی آنزیم به ندرت در داخل نواحی با تراکم بالای CPG می باشد. پس بیشتر جزایر CPG دست نخورده باقی می مانند. حال قطعات حاصل از برش به ۲ دسته تقسیم می شوند.
یک دسته با McrBC هضم آنزیمی می شود و دسته دیگر هضم نمی شود. حال قطعات حاصل روی ژل run شده و قطعات در بازه ی مشخصی (۱-۴kb) انتخاب شده به صورت جدا label دار شده و در array هیبرید می شود.
نسبت شدت هیبریداسیون بین قطعات DNA تحت هضم آنزمی mcrBC و قطعات هضم نشده، میزانی از میتلاسیون را مشخص می کند.

                                                                                                      (Comprehensive High-throughput arrays Relative methylation) CHARM

الیگونوکلئوتیدهای موجود در microarray شامل نواحی برش هستند که کاهش هیبریداسیون را در صورت برش در ناحیه ی مورد نظر نشان می دهد ودر این راستا توالی های متیله شناسایی می شوند.
هیبریداسیون DNA در tailing array و مقایسه ی ان با قطعات برش نخورده نشان می دهد که کاهش هیبریداسیون نشان دهنده برش خوردن توالی در وسط ناحیه ی شناسایی است.

روش (Microarray-based methylation assessment of single samples (MMASS :
یک روش بهینه برای شناسایی نواحی CPG در طول ژنوم که به طور مستقیم از طریق مقایسه توالی های متیله و غیرمتیله درون یک نمونه مشخص می شود.
روش کار: DNA با آنزیم MseI (جایگاه برش TTAA) برش خورده و با آداپتور مناسب ligate می شود.
نصف توالی ها با mcrBC و نصف دیگر با ترکیبی از آنزیم های حساس به میتلاسیون (که نواحی غیر متیله را برش می دهد) برش می خورند.به قطعات حاصل از برش ها linker اضافه کرده و PCR می کنیم حال قطعات غیر متیله و متیله را label دار کرده و در CPG island array هیبرید می کنیم.

                                                                                                         (Microarray-based methylation assessment of single samples) MMASS

جمع بندی روش های مبتنی بر هضم انزیمی

                                                                                       جمع بندی روش های مبتنی بر هضم انزیمی

Affinity- based Approaches:
روش هایی هستند که با استفاده از آنتی بادی های mC-5 یا پروتئین های متصل شونده به گروه متیل قطعات DNA حاوی میتلاسیون را گیر می اندازند.

روش (Methyl-DNA immune precipitation (MeDIP :
روش کار : DNA به کمک سونیکاسیون برش می خورد سپس دناتوره شده ودر معرض آنتی بادی های ۵mC قرار می گیرد. برای جدا کردن قطعات متصل به antibody از مگنت استفاده می کنند و در نهایت شست و شو انجام داده و DNA را جدا می کنند. حال قطعه DNA میکرواری یا توالی یابی بررسی می شود.

                                                                                       : Methyl-DNA immune precipitation (MeDIP)

روش MeDIP sequence

                                                                                      روش MeDIP sequence

                                                                                                   روش MeDIP sequence

روش (Methylated –CPG island Recovery Assay (MIRA :

DNA توسط MseI برش می خورد، لینکرها اضافه می شوند و سپس در معرض MBD_2 و MBD_3 قرار می گیرند. این پروتئین ها به نواحی متیله متصل شده و در نهایت DNA تکثیر می شود. قطعات DNA حاصل توسط میکرواری یا توالی یابی آنالیز می شوند.

                                                                                                       (Methylated –CPG island Recovery Assay)MIRA :

این ۲ روش، ابزارهای مناسبی برای آنالیز نواحی CPG و توالی های تکراری هستند اما هر دوی این روش ها نسبت به نواحی کم متیله حساسیت پائینی از خود نشان می دهند.

– MDB ها قابلیت اتصال به DNA 2 رشته را دارند اما ۵mC ab تنها DNA تک رشته متصل می شوند. این مسئله مهمترین محدودیت استفاده از antibody می باشد زیرا نواحی غنی از CPG به سختی دناتوره می شوند و حتی بعد از دناتوره شدن تمایل به ایجاد فرم ساختار دوم را دارند.

* بین روش های MeDIP و MIRA ، MeDIP نسبت به تفاوت متیلاسیون در نواحی کم متیله حساس تر است در حالیکه MIRA بیشتر در نواحی غنی از CPG از جمله جزیره های CPG حساس می باشد.

مقایسه دو روش MeDIP و MIRA

مقایسه دو روش MeDIP و MIRA

جمع بندی روش های Affinity based approaches

                                                                                         جمع بندی روش های Affinity based approaches

Chemical conversion:
این تکنیک از بی سولفات برای ایجاد تغییر در توالی DNA و تبدیل C به U استفاده می کند اما قابلیت تبدیل ۵mc را ندارد.
در توالی C تبدیل شده به U پس از PCR تبدیل به T می شوند.

                                                                                                      Chemical conversion:

Chemical conversion:

آنالیز توالی های تغییر داده شده با بی سولفات :
این روش یک روش استاندارد ودرست در راستای بررسی میتلاسیون است زیرا راهکاری کمّی – کیفی و کارآمد را در شناسایی ۵mc در کیفیت تک جفت بازی فراهم می کند.
روش کار: بعد از اضافه شدن سدیم بی سولفات سیتوزین به اوراسیل تبدیل می شود. پس تکثیر به واسطه ی PCR اوارسیل به تعیین تغییر پیدا می کند. سطح میتلاسیون DNA می تواند از طریق PCR مستقیم و یا کلون کردن بررسی شود.
استفاده از روش sequencing : بررسی سطح میانگین میتلاسیون
استفاده از روش sub cloning : بررسی توزیع الگوی میتلاسیون تک مولکولی.

                                                                                                            آنالیز توالی های تغییر داده شده با بی سولفات :

تفسیر نتیجه ی توالی یابی میتلاسیون :

وجود پیک c دلالت بر وجود ۵mc در ژنوم و وجود پیک T دلیل بروجود C غیر متیله است. پیک های تکی و Single نشان دهنده ی میتلاسیون کامل و تبدیل شدن درست و صحیح کل C ها به U است.
اما در صورت میتلاسیون جزئی و تبدیل ناکامل سبب ایجاد هر ۲ پیک Tو C در یک زمان در کنار هم می شود.

                                                                                                    تفسیر نتیجه ی توالی یابی میتلاسیون

Sub cloned Sequencing:
در این روش DNA بعد از تغییرات با بی سولفات، PCR می شود( با استفاده از پرایمرهای غیر وابسته به میتلاسیون) سپس روی ژن رفته و براساس اندازه جدا می شود. سگپس قطعات DNA را در باکتری Ecaliو کلون های انتخابی (حدود ۱۰-۵ تا ) را توالی یابی می کنیم.
جزئیات آنالیز میتلاسیون DNA به واسطه توالی یابی قطعات DNA کلون شده ممکن می شود، از آن جا که هر کلون مربوط به یک مولکول منفرد از مجموعه ی اصلی DNA می باشد.
که در مقایسه با روش های دیگر این متد واقعی ترین و جزئی ترین اطلاعات را در مورد میتلاسیون DNA برای هر ناحیه CPG را اراده می دهد و به این دلیل به روش Gold و استاندارد در این زمینه شناخته شده است.

                                                                                                          

Next generation sequencing:
پیشرفت سریع روش NGS که توانایی ایجاد میلیون ها مدل خوانش را که مربوط به یک مولکول DNA است را بدون نیاز به Sub cloning دارد، این امکان را ایجاد می کند که از تکنیک بی سولفات به همراه NGS برای آنالیز میتلاسیون در طول کامل ژنوم DNA استفاده کنیم.
پرکاربردترین NGS ها در آنالیز میتلاسیون :
– ۴۵۴ sequencing
– Illumina Solexa sequencing

                                                                         Next generation sequencing:

روش (Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS:
یک روش کارآمد برای شناسایی و آنالیز میتلاسیون ژنوم در سطح تک نوکلئوتیدی می باشد. این تکنیک تلفیقی از روش هضم آنزیمی و تغییرات حاصل از بی سولفات است در راستای شناسایی جایگاه های سرشار از CPG .

مزایای این روش:
– استفاده از آنزیم محدود کننده خاص. هضم با MSPI یا هر آنزیم دیگری که CPG را شناسایی و برش دهد و سبب ایجاد قطعاتی شود که انتهای آن CG دارد.
– قطعاتی که کوتاه هستند نیز شامل نواحی پروموتری و هم چنین توالی های تکراری که آنالیزشان با روش های سنتی قابل شناسایی نیست می باشد.
– حتی مقدار کم DNA نمونه بین ng 300-10 برای آنالیز کافی است. نیازی به داشتن DNA با کیفتی بالا ندارد.
– نیازی به نمونه ی تازه و زنده ندارد و نمونه های Formalin-Fixed و یا paraffin-embedded نیز کفایت می کند.

 (Reduced Representation Bisulfite Sequencing) (RRBS)

پرکاربردترین استفاده ها از این روش در :
۱- شناسایی میتلاسیون در ژنوم سرطانی : میتلاسیون نادرست در سرطان بسیار دیده می شود که شامل میتلاسیون زیاد و کم می باشد. از آن جائیکه این روش بسیار حالت بالایی دارد پروفایل برای آنالیز کلی میتلاسیون به سرعت ایجاد می شود. این تکنیک از لحاظ قیمت – سرعت و زمان بسیار به صرفه است.
۲- سطح میتلاسیون در تکامل : سطوح متفاوت میتلاسیون در اورگانیسم زنده مشاهده می شود، تغییرات در سطح میتلاسیون سرتاسری و مشاهده و آنالیز آن توسط این تکنیک برای بررسی بیولوژی تکامل بسیار پرکاربرد است.

روش (Bisulfite Padlock Probes (BSPPS:
این روش به عنوان یک روش آلتوناتیو برای غنی سازی قطعات CPG DNA می باشد.
این پروب شامل نواحی انتهایی مکمل با ناحیه ی هدف می باشد. که از طریق linker بهم متصل شده اند این نواحی انتهایی با قسمت تغییر یافته DNA هیبرید شده و سپس توسط آنزیم پلی و از همانند سازی شده و به شکل دایره در می آید.
با استفاده از توالی linker و ساخت پرایمر براساس آن و سپس PCR می توان صدها پروب را در یک reaction تکثیر کرد. ناحیه غنی از CPG درون پروب نیز در نهایت توالی یابی می شود. قسمتی از DNA که با بی سولفات تغییر یافته است با کمک این پروب ها تکثیر و توالی یابی می شوند.

                                                                     Bisulfite Padlock Probes (BSPPS):

پروب ها شامل ناحیه هضم آنزیم مثل ناحیه شناسایی mmeI می باشد که به رابطه ی عملکرد آن قطعات مختلف از لحاظ اندازه ایجاد شده که انتخاب می شوند سپس از طریق NGS نواحی متیله آنالیز می شوند.

محدودیت اصلی این متد bias وابسته به توالی در DNA پلیمراز ، لیگاند، طراحی پروب و کارآیی هیبریداسیون است.

                                                                                              

روش (Combined bisulfite Restriction analysis (COBRA :
روش بررسی کمی سطوح میتلاسیون در جایگاه های خاصی از ژنوم برروی توالی DNA در نمونه های کم و کوچک.

روش کار:

۱- تیمار با بی سولفات

۲- تکثیر با PCR

۳- هضم آنزیمی : مثل BstUL که تنها در نواحی متیله برش ایجاد می کند.

۴- بردن روی ژل

۵- تحلیل و آنالیز کمی

* قطعه های برش خورده با آنزیم و برش نخورده در ژن بررسی می شوند و طبق فرمول صفحه بعد محاسبه می گردند.
میتلاسیون %= (خورده برش قطعات)/(قطعات برش نخورده+قطعات برش خورده) ×۱۰۰

مقدار کمی قطعات DNA توسط دستگاه Phosphoimager محاسبه می شوند.

                                                                                 Combined bisulfite Restriction analysis( COBRA

Combined bisulfite Restriction analysis( COBRA

در آخر :
بعد از مقایسه ی روش های مختلف، روش (Whole Genome Sodium Bisulfite Sequencing(WGSB مهمترین تکنیک شناسایی به دلیل عملکرد عالی، پوشش بالا و کیفیت خوب می باشد و امروزه به دلیل گسترده شدن استفاده از تکنیک های next generation sequencing بسیار مورد توجه قرار گرفته است.
چالش های بررسی میتلاسیون :

۱- CpG Coverage bias : بهترین پوشش ناحیه CPG را تکنیک های برپایه Affinity دارند که نواحی متیله را قبل از توالی یابی شناسایی می کنند. در مقایسه با این روش، تکنیک WGSBS زمان زیادی را برای همان میزان پوشش دهی مصرف می کند.

۲- CPG density bias : نسبت به دیگر تکنیک ها، روش های بر پایه Affinty در ناحیه ی غنی و متراکم از CPG بهترین کارآیی را دارند و نتایج آنها کمتر دچار انحراف می شود.

۳- Copy number bias : تغییرات ژنتیکی مثل copy number های نابجا در بسیاری از بیماری ها مثل سرطان دیده می شوند. جدا کردن ژنوم بر مبنای میتلاسیون با استفاده از روش های بر پایه هضم آنزیمی و Affinity، امکان نمایش اشتباه این Copy ها را در حین آنالیز ایجاد می کنند.

در کل سه فاکتور مهم برای انتخاب روش درست تعین میتلاسیون باید در نظر گرفته شود:
۱- قیمت کم ۲- تفکیک پذیری و دقت بالا ۳- پوشش دهی زیاد

print
Tags: , , , , , , ,


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

پنج × 3 =