تاریخچه ی توالی یابی ژنوم (Genome Sequencing)

توالی یابی ژنوم از روش‌های کلاسیک تا نسل جدید

توالی یابی مولکول DNA از دهه ۱۹۷۰ با معرفی روش ماکسام گیلبرت و پس‌ازآن روش سنگر آغاز شد. روش ماکسام گیلبرت، با استفاده از آنزیم عملی می باشد و نام دیگر آن روش شیمیایی است و به نسخه های متعددی از یک قطعه DNAنیاز دارد. ابتدا فسفات دم ۵ یا ۳ انتهایی نشان‌دار می‌شود. سپس توسط آنزیم اندونوکلئاز محدودالاثر ،DNA به قطعه های نامساوی تبدیل می‌شود که هرکدام دارای یک فسفر نشان‌دار هستند. در مرحله بعد دو رشته DNA توسط حرارت از هم جدا می شوند و توسط الکتروفورز از یکدیگر مجزا میگردند. سپس به روش شیمیایی خاصی نوکلئوتیدها را جدا نموده و توالی DNA را تعیین می‌کنند. تیمار شیمیایی قطعات با مواد مختلفی انجام میگیرد. فورمیک اسید برای دپورینه کردن آدنین و گوانین به کار می‌رود. گوانین تحت تیمار دی متیل سولفات، متیله می‌شود. پریمیدین¬ها با هیدرازین، هیدرولیز می شوند. پس‌ازاین تیمارهای شیمیایی، قطعات نشان‌دار حاصل از برش بر اساس اندازه بر روی ژل قرارگرفته و درنهایت با استفاده از اتورادیوگرافی توالی DNA موردنظر مشخص می‌گردد.
اما امروزه روش ارائه‌شده توسط فردریک سنگر در سال ۱۹۷۵، در بسیاری از روشهای توالی یابی مورداستفاده قرار می‌گیرد. این روش که به روش خاتمه زنجیره معروف است، شامل واکنشی است که در آن قطعات DNA الگوی تک‌رشته‌ای، پرایمر¬های توالی یابی DNA، آنزیم DNA پلی مراز، داکسی نوکلئوتید¬ها و دی داکسی نوکلئوتید¬ها (نوکلئوتیدهایی که فاقد گروه هیدروکسیل لازم برای تشکیل پیوند فسفودی استری در انتهای ۳ خود هستند و همین عامل توقف تکثیر با شرکت آن‌ها در زنجیره در حال ساخت می‌شود) حضور دارند. دی داکسی نوکلئوتید¬های شرکت‌کننده در واکنش با رادیواکتیو و یا فلورسانس نشان‌دار می‌باشند. این روش از چهار واکنش توالی یابی مجزا تشکیل‌شده است که هرکدام دارای هر چهار داکسی نوکلئوتید به همراه یکی از دی داکسی نوکلئوتید ها هستند. در هر لوله به‌صورت مجزا فرآیند تکثیر انجام میگیرد. پس از خاتمه تکثیر، قطعات حاصله دناتوره شده و بر روی ژل الکتروفورز بر اساس اندازه جدا می شوند. باندهای حاصله درنهایت با استفاده از اتورادیوگرافی و یا نور فرابنفش مشخص می گردند. لازم به ذکر است که در این روش برای مشخص کردن نهایی توالی‌های حاصله می‌توان یا از نوکلئوتیدهای نشان‌دار با فسفر رادیواکتیو بهره برد و یا این‌که از پرایمرهایی که در انتها بارنگ فلورسانس نشان‌دار شده اند استفاده نمود .
با توجه به این‌که در هرکدام از لوله ها یکی از دی داکسی نوکلئوتیدها استفاده‌شده است و بر مبنای خاتمه زنجیره، قطعاتی با طول متفاوت حاصل‌شده است، موقعیت نسبی باندهای متفاوت در هرکدام از چهار چاهک مربوط به ژل موردنظر، از پایین به بالا، مشخص‌کننده توالی DNA موردنظر ما می باشند.

دو روش کلاسیک توالی یابی ماکسام گیلبرت(بالا) و سنگر(پایین)

توالی یابیدو روش کلاسیک توالی یابی ماکسام گیلبرت(بالا) و سنگر(پایین)پیشرفت در فن‌آوری توالی یابی و برنامه¬های کامپیوتری امکان انجام توالی یابی سریع و مقرون به‌صرفه را فراهم کرده است.درگذشته توالی یابی کل ژنوم ارگانیسم¬ها مشکل و زمان‌بر بود. در مورد پروژه ژنوم انسان که در سال ۱۹۹۰ آغاز شد، تصور براین بود که توالی یابی ژنوم انسان ۱۵ سال طول می¬کشد، اما این پروژه در سال ۲۰۰۳ به پایان رسید. هزینه این پروژه، که کل ژنوم انسان با روش‌های اولیه موردتوالی یابی قرار گرفت، در حدود ۳ میلیارد دلار برآورد شد. در شکل۲ به تکامل روش‌های توالی یابی و رخدادهای تاریخی مهم در مورد توالی یابی ژنوم اشاره شده است:

: روند تکامل روش‌های توالی یابی و تاریخچه توالی یابی ژنوم: روند تکامل روش‌های توالی یابی و تاریخچه توالی یابی ژنوممدت‌زمان توالی یابی ژنوم انسانی در سال ۱۹۹۸ با ورود روکویل، که شرکتی خصوصی با رهبری دکتر کریگ ونتر بود، سرعت گرفت. ژنومیکس سلرا بر اساس روش شات گان (که در آن بر اساس ایجاد قطعات بلند تصادفی از DNA که در داخل ناقل¬ها برای تشکیل کتابخانه ژنومی قرار می¬گیرند و تعداد زیادی مولکول‌های DNA نوترکیب ایجاد می¬کنند) بود. این فن‌آوری روشی سریع¬تر برای آنالیز کل اطلاعات ژنوم فراهم می¬آورد به‌گونه‌ای که توالی یابی ژنوم انسانی با این روش در مقایسه با پروژه ژنوم انسانی در مدت‌زمان کوتاه¬تری در مقایسه با ۱۳ سال مدت‌زمان پروژه ژنوم انسانی و با روشی مطمئن¬تر انجام شد. علاوه بر این پروژه ژنوم سلرا در مقایسه با پروژه ژنوم انسانی کاهش هزینه ۹۰ درصدی نشان داد (۳۰۰ میلیون دلار در مقابل ۳ میلیارد دلار).
روش pyrosequencing توسط پال نایرن در سال ۱۹۹۰ ارائه شد که روش توالی یابی بر اساس سنتز می‌باشد. در این روش ضرورتا یک رشته DNA با سنتز رشته مکمل خود توالی یابی می‌شود. در این روش شرکت هرکدام از نوکلئوتید¬ها باعث ایجاد یکسری واکنش¬های آنزیمی می‌شود که یک سیگنال نوری برای آنالیز فراهم می‌سازد.

روش¬های ۴۵۴ Life Science بر اساس استفاده از واکنش زنجیره¬ای پلی مراز عرضه‌شده‌اند. این روش شامل شکستن DNA ژنومی به قطعات و قرار دادن آن‌ها بر روی دانه های میکرونی می¬باشد که به طرز ویژه‌ای طراحی‌شده است. سپس چندین کپی از این قطعات از طریق واکنش زنجیره¬ای پلی مراز بر روی آن‌ها ایجاد می‌شود. مدت‌زمان توالی یابی ژنوم انسانی با این روش کمتر شده و به ۱۰ روز کاهش یافت.

برای توالی یابی در مقیاس ژنومی و قطعات بزرگ DNA، روش‌های متعددی وجود دارد . سه مورد از آن‌ها که به‌صورت وسیع مورداستفاده قرار می¬گیرند شامل سیستم Roche/454 FLX، سیستم Illumina/ Solexa Genome Analyzer و سیستم Applied Biosystems SOLiD می‌باشد. علاوه بر این سه سیستم، امروزه دو سیستم دیگر موردتوجه قرارگرفته¬اند که برای توالی یابی ژنومی استفاده می¬شوند. این دو سیستم شامل، Helicos Heliscope و ابزار¬های Pacific Biosciences SMRT می‌باشند.

هرکدام از این روش¬ها دربردارنده ترکیبی از آنزیم شناسی، شیمی، دوربین¬های باکیفیت بالا و مهندسی نرم‌افزار و سخت‌افزار هستند. این روش¬ها به مراحل آماده¬سازی نمونه بسیار ساده¬ای قبل از توالی یابی DNA نیاز دارند. همین مسئله باعث صرفه‌جویی در زمان می‌شود. روش¬های نوین توالی یابی به ابزار¬های کمتری در مقایسه با روش¬های توالی یابی با ظرفیت بالا که بر اساس همسانه سازی هستند، نیاز دارند.
در این فن¬آوری¬ها، با انجام اقداماتی متفاوت از روش‌های سنتی امکان تکثیر تک رشته¬های موجود در کتابخانه قطعات فراهم می‌شود. سپس واکنش‌های توالی یابی بر روی رشته¬های تکثیرشده انجام می¬گیرد. قطعات تکثیرشده که انتهای صاف دارند و به‌طور مستقیم از ژنوم و یا منبع DNA موردنظر فراهم شده‌اند، به رابط‌هایی که برای هر توالی اختصاصی هستند، متصل شده و کتابخانه تشکیل می‌گردد.
در این روش¬ها به دلیل حضور توالی‌های سازگارساز، مولکول¬ها می¬توانند به‌صورت منتخب با واکنش زنجیره¬ای پلی مراز تکثیر شوند. بنابراین به مراحل همسانه سازی باکتریایی به‌عنوان مرحله حد واسط برای تکثیر قطعه موردنظر (که در روش¬های سنتی توالی یابی انجام می¬گیرد)، نیازی ندارند.
به‌طورکلی همان‌طوری که در بالا نیز اشاره شد، کاهش مدت‌زمان لازم برای رسیدن به‌توالی قطعه موردنظر و بازدهی بالای روش-های توالی یابی پسا ژنومی، در کنار سادگی مراحل آماده‌سازی نمونه¬ها برای توالی یابی با این روش¬ها، امکان توسعه آن‌ها را نیز فراهم آورده است. در این فصل به تعدادی از این روش¬های نوین توالی یابی به‌عنوان نسل بعدی توالی یابی اشاره خواهد شد.

توالی یابی pyrosequencing
جایگزین اول برای توالی یابی سنگر، روش pyrosequencing می¬باشد. این روش در موسسه سلطنتی سوئد برای اولین بار معرفی شد. اساس این نوع از توالی یابی، سنتز توالی DNA و شناسایی نور لومینسانس منتشر شده از لوسیفرین در زمان واقعی است. دقت و صحت بالا، انعطاف‌پذیری به همراه پردازش هم‌زمان چندین نمونه و خودکار بودن آن ازجمله مزایای این روش می-باشد. این روش برای تعیین ژنوتیپ و تشخیص چندشکلی‌های تک نوکلئوتیدی مورداستفاده قرار می¬گیرد. اما به دلیل محدود بودن اندازه توالی موردبررسی در این روش، توالی یابی pyrosequencing برای مطالعه و توالی یابی کل ژنوم مناسب نمی-باشد.
روش تعیین توالی pyrosequencing، بر اساس تشخیص پیروفسفات آزادشده در هنگام سنتز DNA است. در این روش مجموعه¬ای از آنزیمها شرکت دارند که یک نور مرئی تولید می¬کنند. این نور با تعداد نوکلئوتید گنجانده‌شده در زنجیره در حال ساخت، متناسب است.
چهار آنزیم شرکت کننده در این توالی یابی شامل لوسیفراز، سولفوریلاز، DNA پلی مراز و آپیراز می‌باشد. علاوه بر این آنزیم¬ها، در واکنش آنزیمی مربوط به این نوع از توالی یابی، نوکلئوتید¬های سه فسفاته، لوسیفرین، آدنوزین فسفوسولفات و همچنین رشته الگو و پرایمر اختصاصی مورداستفاده قرار می‌گیرند.

مراحل توالی یابی pyrosequencing

در توالی یابی pyrosequencing، ابتدا رشته الگو با استفاده از دو پرایمر اولیه تکثیر می‌شود. در مرحله بعدی محصول PCR واسرشته می‌گردد و تک رشته¬های حاصل به بیوتین متصل شده و با کمک استرپتوآویدین به دام افتاده و رشته‌های مکمل شسته می¬شوند.
در مرحله بعد، مواد لازم برای توالی یابی اضافه‌شده و واکنش آغاز می‌گردد. آبشار آنزیمی با واکنش پلی مریزاسیون اسید نوکلئیک شروع می‌شود. در واکنش آنزیمی اول به دلیل استفاده نوکلئوتید¬های سه فسفاته و وارد شدن آن‌ها در ساختار رشته‌ی در حال سنتز، یکی از فسفات¬ها وارد رشته می‌شود و پیروفسفات آزاد می‌شود. پیروفسفات آزادشده به‌عنوان سوبسترا برای آنزیم ATP سولفوریلاز عمل کرده و برای تولید ATP مورداستفاده قرار می‌گیرد. مولکول پرانرژی ATP حاصل، سوبسترای سومین واکنش آنزیمی است که با آنزیم لوسیفراز برای اکسیداسیون لوسیفرین و تولید نور به کار می‌رود.

واکنش¬های آنزیمی توالی یابی pyrosequencingازآنجاکه ماهیت نوکلئوتید اضافه‌شده شناخته‌شده می¬باشد، به کمک دوربین¬های شناسایی کننده نور¬های به‌دست‌آمده، توالی رشته در حال سنتز به‌راحتی تعیین می‌شود.
توالی یابی pyrosequencing می¬تواند در فاز مایع و یا جامد انجام گیرد.
توالی یابی pyrosequencing در فاز جامد با بهره‌گیری از DNA تثبیت‌شده در سیستم آنزیمی است. همان‌طور که قبلاً اشاره گردید با شرکت سه آنزیم انجام می¬گیرد. این سیستم یک مرحله شستشو دارد که بعد از اضافه کردن نوکلئوتید¬ها انجام می-گیرد. اینکار برای شستشوی باقیمانده نوکلئوتید¬های شرکت نکرده در واکنش صورت می‌گیرد.
در توالی یابی pyrosequencing در فاز مایع ، علاوه بر سه آنزیم فوق از آنزیم دیگری به نام آپیراز استفاده می‌شود که برای تخریب نوکلئوتید¬های باقیمانده به کار می‌رود. حضور آنزیم آپیراز امکان انجام واکنش توالی یابی در داخل یک لوله را فراهم می-کند.
انواع توالی یابی pyrosequencing: سمت راست در فاز مایع و سمت چپ در فاز جامد

انواع توالی یابی pyrosequencing: سمت راست در فاز مایع و سمت چپ در فاز جامد

ازجمله مزایای توالی یابی pyrosequencing می‌توان به موارد زیر اشاره نمود:

اول، این روش به پرایمر¬های اختصاصی نشان‌دار و یا نوکلئوتید¬های نشان‌دار و ژل الکتروفورز نیازی ندارد.

دوم، واکنش آنزیمی مربوط به این روش به‌راحتی در دمای اتاق و pH فیزیولوژیکی رخ می‌دهد.

سوم، با استفاده از این نوع توالی یابی می‌توان به‌صورت هم‌زمان چندین توالی را پردازش نمود.این خود دلیلی برای مقرون‌به‌صرفه بودن توالی یابی pyrosequencing می‌باشد.
در کنار مزایای فوق این روش دارای معایبی نیز می‌باشد. در توالی یابی pyrosequencing در فاز جامد با توجه به نیاز به یک مرحله شستشو بعد از هر بار افزودن نوکلئوتید¬ها، کاهش سیگنال به دلیل از دست دادن الگو رخ می‌دهد. همچنین در pyrosequencing در فاز مایع، ممکن است فعالیت آنزیم آپیراز به دلیل تجمع محصولات حد واسط کاهش یابد.

توالی یابی Roche 454
یکی از روش¬های نسل جدید توالی یابی که اولین بار به‌صورت تجاری در دسترس قرار گرفت روش توالی یابی۴۵۴ می‌باشد و در سال ۲۰۰۴ توسط مارگویلیز و همکاران و شرکت ۴۵۴ Life Sciences عرضه شد. دومین توالی کامل ژنومی که توالی یابی شد با استفاده از این فن¬آوری توسط ولر و همکاران در سال ۲۰۰۸ انجام شد . آن‌ها با استفاده از توالی یابی ۴۵۴ ژنوم جیمز واتسون را توالی یابی نمودند.
توالی یاب ژنومی ۴۵۴ از فن¬آوری توالی یابی تکنیک pyrosequencing استفاده می¬کند . در فرایند pyrosequencing ، شرکت هر نوکلئوتید با DNA پلی مراز منجر به آزادسازی پیروفسفات می‌شود. این خود سبب شروع یک سری واکنش¬های پایین‌دستی می‌شود که درنهایت توسط آنزیم لوسیفراز یک طیف نوری را تولید می¬کند. میزان نور تولیدشده، تعداد نوکلئوتید¬های شرکت‌کننده در واکنش را نشان می¬دهد. در این سیستم توالی یابی،برخلاف توالی یابی ساچمه‌ای (که در آن قطعات کوچک در ژنوم پروکاریوتی همسانه شده و توالی یابی می‌گردد)، توالی یابی کل ژنوم بدون نیاز به همسانه کردن در باکتری اشرشیاکلی و یا هر میزبان دیگر امکان‌پذیر می‌شود.

تکنیک pyrosequencing به‌عنوان اساس فن¬آوری Roche 454 محسوب می‌شودتکنیک pyrosequencing به‌عنوان اساس فن¬آوری Roche 454 محسوب می‌شوددر این روش ابتدا DNA به‌صورت تصادفی به قطعات کوتاه‌تر تبدیل می‌شود و به توالی‌های سازگار ساز متصل می‌شود. سپس به مولکول¬ها اجازه اتصال به مولکول‌های موجود بر روی دانه‌ها داده می‌شود. در روش توالی یابی ۴۵۴ ، تکثیر قطعات با PCR امولسیونی صورت می¬گیرد که در آن قطعات در یک محلول حاوی روغن حل می¬شوند و هرکدام از آن‌ها حکم یک واکنش رادارند. دانه¬های موجود در ابعاد ماکرو و یا نانو هستند که با روش نانوتکنولوژی ساخته‌شده‌اند. این دانه‌ها دارای توالی-هایی مکمل قطعات هستند. با تغییر متوالی در دما، واکنش تکثیر بر روی قطره مربوطه انجام می¬گیرد.

مجموعه¬های بسیار زیادی از این دانه‌ها را بر رویPicoTiterPlate (PTP: که دارای ساختاری مویینه همراه با سیلیکا می¬باشد) قرار می¬دهند به‌طوری‌که هر دانه در داخل یک حفره قرار می¬گیرد. در مرحله بعدی دانه¬های آنزیمی اضافه می¬شوند. با انجام واکنش تکثیر و افزوده شدن هر نوکلئوتید تصویر برداری با دوربین¬های خاص صورت می¬گیرد. آنالیز سری تصاویر به‌دست‌آمده، توالی قطعات را مشخص می¬کند.

روش استفاده‌شده توسط توالی یاب Roche 454 برای تکثیر کپی¬های DNA تک‌رشته‌ای از یک کتابخانه قطعات بر روی دانه‌های آگاروز

نحوه عمل روش Roche 454 برای توالی یابی
به‌طورکلی تبدیل DNA ژنومی به داده¬های مربوط به‌توالی یابی با استفاده از فن¬آوری Roche 454 را می‌توان در چهار مرحله تقسیم‌بندی نمود:
مرحله اول: آماده‌سازی نمونه DNA
مرحله دوم: فرآیند اختصاصی قرارگیری نمونه¬های آماده‌شده DNA بر روی دانه‌ها
مرحله سوم: توالی یابی DNA
مرحله چهارم: تجزیه‌وتحلیل داده¬های حاصل از دستگاه
نحوه عمل روش Roche 454 برای توالی یابی آماده‌سازی نمونه¬های DNA
این مرحله با کل ژنوم و یا قطعه ژن مورد هدف آغاز می‌شود. مرحله آغازی در سیستم توالی یاب ۴۵۴، تهیه کتابخانه جامعی از هر نمونه می¬باشد. آماده‌سازی این کتابخانه برای توالی یابی هر نمونه DNA مربوط به ویروس، باکتری و یا انسان ضروری می-باشد. اولین مرحله در تهیه کتابخانه ژنومی، شکستن DNA دو رشته¬ای به قطعات دو رشته¬ای کوتاه به طول۶۰۰-۴۰۰ جفت باز است. سپس اتصال سازگارساز¬ها به قطعات شکسته شده می‌باشد. درنهایت قطعات حاصل همراه سازگار ساز دورشته¬ای، تک‌رشته‌ای می‌شوند . برای انجام این مرحله به ابزار خاصی نیاز نیست و توسط کارشناس آزمایشگاه در نیمی از روز قابل انجام است. کتابخانه¬هایی که امروزه تهیه می¬شوند، مواد کافی برای چندین دور توالی یابی با سیستم توالی یاب ژنومی FLX (توالی یابی با روش ۴۵۴) آماده می¬کنند.

مراحل آماده‌سازی نمونه¬های DNA

فرآیند بارگذاری نمونه های آماده‌شده DNA بر روی دانه ها
درروش Roche 454، قطعات کتابخانه با دانه‌هایی از جنس آگاروز در ابعاد میکرونی که در سطح خود الیگونوکلئوتیدهایی رادارند، ترکیب‌شده (با نسبت تقریبی ۱:۱)که این الیگونوکلئوتیدها دارای توالی مشخص بوده و برای کاربرد در توالی یابی ۴۵۴ اختصاصی هستند. بنابراین هر دانه مرتبط با یک قطعه منحصربه‌فرد است. هر یک از این کمپلکس‌های دانه- قطعه، به میسل¬های آب-روغن واحدی وارد می¬شوند که شامل عوامل واکنش زنجیره¬ای پلی مراز هستند. درواقع این ترکیبات تحت تأثیر ورتکس قوی در داخل میسل¬های دارای عوامل ضروری برای تکثیر با واکنش زنجیره¬ای پلی مراز و داخل میسل¬های آبی قرار می¬گیرند که در اطراف با لایه¬ای روغن پوشیده شده¬اند. پس از اعمال چرخه¬های دمایی (در واکنش PCR امولسیونی)، در میسل¬ها تقریباً یک‌میلیون کپی از هر قطعه DNA بر سطح دانه¬ها تولید می¬کنند. پس از کامل شدن فرآیند تکثیر، دانه¬ها از روغن جداشده و تمیز می¬شوند و گروه‌هایی که DNA ندارند و یا آن گروه که دارای چندین نوع DNA هستند، حذف می¬شوند. سپس مولکول‌های تکثیرشده در کنار همدیگر توالی یابی می¬شوند.
این فرآیند تقریباً هشت ساعت طول می¬کشد، درحالی‌که همسانه سازیDNA در باکتری و فرآیند تکثیر تقریباً سه هفته به طول می¬انجامد و می¬تواند در نمونه¬های DNA خطا¬هایی را ایجاد نماید.مراحل قرارگیری نمونه¬های آماده‌شده DNA بر روی دانه¬ها

لازم به ذکر است که در این مرحله، واکنشی که برای تکثیر قطعه موردنظر انجام می‌شود، واکنش زنجیره¬ای پلی مراز می‌باشد. هرچند که به دلیل شرایط انجام واکنش، آن ¬را نوع امولسیونی می‌نامند. درواقع در طی انجام یک PCR امولسیونی ده میلیون کپی یکسان از یک قطعه به دست می¬آید که همه بر سطح دانه¬ها تثبیت‌شده‌اند.

توالی یابی قطعات تکثیرشده موجود بر روی میکرو دانه‌ها
اساس فن¬آوری ۴۵۴ در توالی یابی این است که از سنتز نوکلئوتیدها برای دستیابی به اطلاعات توالی¬ها استفاده می‌شود. در توالی یابی همراه با سنتز، یک قطعه DNA تک‌رشته‌ای با استفاده از یک آنزیم مولد قطعه دو رشته¬ای کپی می‌شود. با شروع از یک انتهای قطعه DNA، آنزیم به‌صورت تدریجی نوکلئوتید¬هایی را که مکمل تک رشته تثبیت‌شده بر روی دانه¬ها هستند اضافه می¬کند. نوکلئوتید¬ها یکی پس از دیگری هم‌زمان با حرکت آنزیم به سمت پایین قطعه تک‌رشته‌ای باهم جفت می¬شوند و به این صورت ساختار نردبانی مارپیچی شکل گسترش پیدا می¬کند.
در مرحله اول دانه¬ها در داخل PicoTiterPlate یا در چاهک ۹۶ تایی برای تکثیر قرار می‌گیرند. هر دانه در هر یک از چندین صد و یا هزار چاهک نگه‌داشته می‌شود. دانه¬های حاصل درنتیجه تکثیر به‌صورت دکوراسیونی از یک‌میلیون کپی از قطعه تک رشته¬ای اولیه درمی‌آیند که بر روی دانه¬ها تشکیل می‌گردد تا این‌که قدرت سیگنالی قوی برای مراحل بعدی فرآیند فراهم کنند. اعتقاد بر این است که PTP مهم‌ترین فن¬آوری پیشرفته توالی یابی است، به این دلیل که امکان مینیاتوری کردن توالی یابی با این تکنولوژی فراهم‌شده است. ساختار این ابزار به‌گونه‌ای است که یک سمت آن صاف بوده و سمت دیگر آن دارای چاهک¬هایی برای قرارگیری دانه¬ها می‌باشد. هرکدام از این چاهکها حجمی برابر ۷۵ پیکولیتر دارند ولی قطر آن‌ها به‌گونه‌ای طراحی می‌شود که تنها یک‌دانه بتواند در آن جای گیرد.
جایگیری با ثبات هرکدام از این قطعات باعث می‌شود که هر واکنش توالی یابی به‌خوبی آشکارسازی شود. سپس دانه¬های حاوی آنزیم کاتالیز کننده مراحل واکنش پایین‌دستی pyrosequencing به PTP اضافه‌شده و سانتریفوژ می¬شوند. تا این‌که به‌گونه‌ای در فضای اطراف پخش شوند که در اختیار دانه¬های آگاروزی قرار گیرند.

مراحل توالی یابی قطعات تکثیرشده موجود بر روی میکرودانه¬ها

بعد از پر شدن چاهک¬ها با دانه¬ها، پلیت مربوطه در سیستم توالی یاب ۴۵۴ قرار داده می‌شود. ابزار مربوطه به‌گونه‌ای است که قادر است چهار نوکلئوتید متفاوت را به‌تدریج وارد پلیت¬ها کند. آنزیم‌های متصل به دانه¬ها که در هرکدام از چاهک¬ها وجود دارند قادرند مواد شیمیایی حاصل از شرکت نوکلئوتید¬ها در فرآیند تکثیر را در یک واکنش شیمیایی لومینسانس (مثل آنچه که در کرم شب تاب اتفاق می¬افتد) تبدیل به نور کنند.

به‌منظور تصویر برداری، ساختار PTP به گونه خاصی عمل می¬کند. به‌منظور ثبت نور¬های ساطع شده از هر دانه، PTP در جهت روبروی دوربین CCD قرار می¬گیرد. دوربین CCD از یک قطعه کوچک مثلثی شکل از جنس سیلیکا به‌جای قطعه فیلم برای دریافت سیگنال نور ورودی استفاده می¬کند که این قطعه خاص سیلیکایی، CCD نام دارد.
در ابتدا برای کالیبراسیون دستگاه، چهار نوکلئوتید (TCGA) مکمل قطعات سازگارساز به‌عنوان پرایمر توالی یابی کننده وارد ساختار کتابخانه میشوند. به دنبال آن جریانی منظم از نوکلئوتید¬ها به داخل چاهکهای مربوط به PTP آغاز می‌شود. استراتژی ورود ترتیبی نوکلئوتیدها این امکان را برای نرم افزار خوانش در روش ۴۵۴ فراهم می‌کند که نور ساطع‌شده از شرکت هر نوکلئوتید در توالی در حال سنتز را تعیین نماید.

نحوه عمل دستگاه توالی یاب 454

مرحله اول شارش تدریجی چهار نوکلئوتید به داخل PPT در طول دور­های همانندسازی، مرحله دوم تولید نور حاصل از اتصال یک نوکلئوتید مکمل به رشته الگو، مرحله سوم ثبت سیگنال نوری با دوربین CCD. قدرت سیگنال حاصل به تعداد نوکلئوتید­های شرکت‌کننده در واکنش بستگی دارد. بعد از تمام شدن توالی یابی کل ژنوم درنهایت، نرم‌افزار یک نمودار بار الکتریکی بر اساس شدت نور به نام «فلوگرام» برای هر چاهک از PTP رسم می­کند.

در صورت وجود چندین باز یکسان متوالی (هموپلی مر)، خوانش توسط این نرم‌افزارها به‌درستی انجام نمی¬گیرد و احتمال خطا-های ورود و یا حذف در طول خوانش و درنهایت در توالی حاصل وجود دارد. برخلاف این، به دلیل این‌که در هر مرحله نوکلئوتید خاصی شرکت می¬کند، احتمال بروز خطا¬های جابجایی درروش توالی یابی Roche 454 بسیار نادر است.
امروزه دستگاه FLX 100، جریان از هر نوکلئوتید را در یک دور ۸ ساعته فراهم می¬کند و به‌طور متوسط طولی برابر ۲۵۰ نوکلئوتید را خوانش می¬کند (که به‌طور متوسط شرکت ۵/۲ جفت باز در هر جریان است).

مرحله آنالیز ژنومی
داده¬های خام حاصل از مراحل ذکرشده فوق درنهایت با نرم‌افزارهای تجزیه‌وتحلیل ۴۵۴ پردازش می¬شوند. سپس با فیلتر¬های کیفیت‌سنجی متفاوتی غربال‌گری شده تا این‌که توالی‌های باکیفیت پایین، توالی‌های مخلوط (که بیش از یک قطعه DNA آغازگر در هر دانه وجود دارد) و توالی‌های بدون توالی آغازگر TCGA حذف شوند. خوانشهای نهایی، به‌طور متوسط دارای کارایی در حدود Mb 100 (صد میلیون باز) هستند.
درنهایت پردازش پایین‌دستی خوانش¬ها، با استفاده از الگوریتم سرهم‌بندی به نام Newbler انجام می¬گیرد که می¬تواند داده-های حاصل از دستگاه FLX را سرهم‌بندی کند.
داده¬های توالی یاب ۴۵۴ که از دستگاه توالی یاب ژنومی FLX به دست می‌آید، دارای مزیت ویژه‌ای ازنظر ظرفیت بالا به همراه طول بلند قطعات خوانش برای ایجاد تصویر پیچیده¬ای از ژنوم است. با حذف خطاهای مربوط به مراحل آماده‌سازی نمونه که در روش¬های توالی یابی سنتی وجود دارد ،تسریع زمان و کیفیت و عمق نتایج توالی یابی در هر دور ازنظر تعداد نوکلئوتید¬های خوانده‌شده در هر دور آزمایش، امکان آنالیز کل ژنوم وجود دارد. نتایج حاصل از دستگاه FLX که به‌صورت چندین فلوگرام می-باشد، جمع‌آوری‌شده و با ژنوم مرجع حاصل به‌عنوان‌مثال پروژه ژنوم انسان، برای تشخیص مناطقی که دارای تطابق هستند و یا متفاوت هستند، مقایسه می¬شوند.

فرآیند پردازش داده های حاصل از دستگاه FLX

فرآیند پردازش داده¬های حاصل از دستگاه FLX

در زیر به تعدادی از مزایا و معایب این فن‌آوری اشاره‌شده است:
اگرچه در این روش توالی‌های کوتاهی در مقایسه با توالی یاب¬های مویینه به دست می¬آید، اما خوانش¬های حاصل از دستگاه FLX دارای طول کافی برای سرهم کردن ژنوم های کوچک مثل باکتری و ویروس باکیفیت بالا، هستند. علاوه بر این به دلیل عدم وجود مرحله همسانه سازی باکتریایی در فرآیند Roche 454 و عدم وجود خطا¬های حاصل در این مرحله و به دلیل عملکرد بهینه دستگاه FLX با استفاده از این فن¬آوری نوین توالی یابی، امکان پوشش ژنومهای بسیار طولانی هم وجود دارد.
در آغاز توالی یاب¬های ۴۵۴ طول خوانشی در حدود ۱۰۰ جفت بازداشتند، اما اکنون می¬توانند به‌طور متوسط طولی برابر ۴۰۰ جفت باز را تولید کنند. ظرفیت حداکثری سیستم¬های ۴۵۴ در حدود ۶۰۰ جفت باز است که برابر نیمی از توانایی توالی یابی با استفاده از روش سنگر است که تقریباً برابر ۱۲۰۰ جفت باز می¬باشد.
توالی یاب¬هایی که دارای ظرفیت ۶۰۰ جفت بازی هستند، بلندترین توالی‌های خوانش کوتاه را در بین همه روش‌های نسل جدید توالی یابی¬ ایجاد می¬کنند. قابلیت تولید قطعات با طول بلند¬تر، نقش بسیار مهمی در شناسایی ایزوفرم¬های RNA درروش RNA-seq و سرهم‌بندی خود به خودی میکروب¬ها در متاژنومیکس برای این فن¬آوری فراهم کرده است.
همان‌طور که در بالا نیز به آن اشاره شد، صحت داده¬های گزارش‌شده از Roche 454 بسیار مطلوب است (بیش از ۹۰%). اما به دلیل وجود توالی‌های هموپلی¬مر امکان گزارش داده¬های مستعد خطا مخصوصاً مرتبط با حذف و اضافه، از چالش‌های مهم برای این روش می‌باشد. در کنار این موضوع، بازدهی پایین خوانش¬های توالی عاملی برای قیمت بالای این روش در استفاده از آن برای پوشش دادن کل ژنوم موجود زنده محسوب می‌شود.

توالی یابی (Illumina (Solexa
یکی دیگر از تکنولوژی¬های نسل جدید توالی یابی در سال ۲۰۰۶ توالی یابی Illumina می‌باشد. تفاوت این روش با ۴۵۴ در نحوه تکثیر قطعات و استفاده از نوکلئوتید¬های خاتمه دهنده زنجیره می¬باشد. در این تکنولوژی، PCR به‌صورت پل انجام می‌شود. تکثیر بر روی صفحات جامد صورت می¬گیرد. که در آن صفحات، توالی‌های مکملی¬ برای سازگار ساز متصل شده به قطعات موردنظر به‌صورت درجا و تصادفی قرارگرفته است. قطعات پس از اتصال به‌توالی¬های مکمل خودشان بر روی صفحه می¬توانند با حرکت از جانب دیگر نیز با سازگار ساز متصل به انتهای رشته به‌توالی دیگری بر روی صفحه متصل شوند و یک پل تشکیل دهند. با تغییر در دما به‌صورت مکرر، قطعات تکثیر می¬شوند. در مرحله بعد با واسرشته کردن دو رشته¬ای¬ها، تکثیر قطعات با افزودن نوکلئوتید¬های نشان‌دار شده با فلورسانس، که انتهای ۳ آن‌ها بلوکه‌شده، انجام می‌شود. در هر مرحله با اضافه شدن آن‌ها، بلوک برداشته‌شده و نور ساطع‌شده تصویربرداری می‌شود. با سنجش شدت نور¬های به‌دست‌آمده، توالی DNAمشخص می‌گردد.

نمایی از PCR به‌صورت پل (Bridge PCR)

اساس کار توالی یابی (Illumina (Solexa
برخی از روش¬هایی که در نسل جدید توالی یابی¬ها معرفی‌شده‌اند، در حقیقت ترکیبی از مفاهیم ارائه‌شده در طول سالیان گذشته تاریخ علم زیست‌شناسی، کامپیوتر و تصویربرداری هستند. این سیستم شامل استفاده از خاتمه دهنده¬های رنگی قابل برگشت در توالی یابی آنزیمی قطعات کتابخانه تهیه‌شده می¬باشد. این سیستم در سال ۲۰۰۷ با Solexa معرفی شد و توسط Illumina به کار گرفته شد.

فن¬آوری Illumina نیز همانند سایر روش¬های نوین توالی یابی دارای چندین مرحله به شرح زیر است:
اول: فرآیند ساخت کتابخانه ژنی
دوم: ایجاد مجموعه¬های Illumina حاصل از واکنش زنجیره¬ای پلی مراز
سوم: توالی یابی بر اساس سنتز با استفاده از خاتمه دهنده¬های رنگی قابل‌برگشت

ساخت کتابخانه ژنی برای توالی یابی با فن¬آوری Illumina
مراحل تهیه کتابخانه ژنی در این سیستم همانند فن¬آوری Roche 454 بوده و شامل قطعه قطعه کردن مولکول DNA با وزن مولکولی بالا، دست‌کاری آنزیمی، آدنیلاسیون انتهای قطعات و اتصال سازگار سازهای اختصاصی می‌باشد.

ایجاد مجموعه¬های Illumina حاصل از واکنش زنجیره¬ای پلی مراز
مرحله تکثیر تک‌مولکولی برای آنالیز ژنومی Illumina، با یک کتابخانه شامل سازگار ساز اختصاصی Illumina، بر سطح فلو سل هایی که دارای مشتقاتی از الیگونوکلئوتید می‌باشند و با یک دستگاه خودکار به نام Cluster Station انجام میگیرد.

فلو سل در این سیستم از جنس شیشه بوده و با ابعاد میکرونی دارای هشت کانال و دارای برچسب  از جنس DNA می‌باشد. این وسیله امکان تکثیر قطعات به صورن پل را در سطح خود فراهم میکند.

مجرای میکروفلوئیدی Illumina، یک فلو‌سل متشکل از شیشه¬های مسطح با هشت کانال میکروفلوئیدی است. هرکدام از آن‌ها با پیوند‌هایی کوالانسی به سازگار سازهایی متصل هستند که مکمل سازگار سازهای کتابخانه تهیه‌شده می باشند. با کمیت سنجی دقیق غلظت کتابخانه، محلول رقیق‌شده دقیقی از قطعات کتابخانه در سطح فلوسل¬ها با استفاده از روش پل PCR تکثیر می یابند و مجموعه‌های ژنی را تهیه می‌کنند.
کتابخانه¬های گوناگون میتوانند به هرکدام از هشت کانال موجود اضافه شوند و یا این‌که از یک نوع کتابخانه در همه هشت کانال و یا ترکیبی از هر دو استفاده ¬شود. مجموعه¬های به‌دست‌آمده تقریباً شامل یک‌میلیون کپی از قطعه اصلی هستند. این تعداد کپی برای گزارشی که توسط دستگاه در مورد باز¬های شرکت‌کننده بر اساس شدت سیگنال¬های حاصل ارائه می‌شود کافی است.

ایجاد مجموعه¬های Illumina حاصل از واکنش زنجیره¬ای پلی مراز

 توالی یابی بر اساس سنتز با استفاده از خاتمه دهنده¬های دارای رنگ قابل‌برگشت
Illumina از توالی یابی بر اساس تکثیر استفاده می¬کند. در این سیستم چهار نوکلئوتید به‌طور تدریجی به کانال¬های فلو سل¬ها اضافه می¬شوند و با DNA پلی مراز موجود در ساختار مجموعه¬هایی از الیگونوکلئوتید¬ها را تشکیل می¬دهند. نوکلئوتید¬ها به‌صورت اختصاصی دارای یک نشانگر فلورسانس برای هر باز هستند. گروه ۳́ – OH آن‌ها به‌صورت شیمیایی بلوکه‌شده‌اند. به‌گونه‌ای که هرکدام از واکنش¬های مربوط به شرکت نوکلئوتید¬ها، یک رویداد منحصربه‌فرد است. به دنبال مرحله تکثیر و شرکت نوکلئوتید¬ها در ساختار رشته‌های در حال گسترش، نوکلئوتید¬ها و DNA پلی مراز اضافی شسته می¬شوند.
همان طور که در بالا اشاره شد، ادامه تکثیر و شرکت نوکلئوتید¬های بعدی تحت تأثیر واکنش شیمیایی مربوط به انتهای قطعاتی است که سازگار سازهایی مکمل قطعات موجود بر روی فلوسل رادارند و ادامه تکثیر مستلزم بلوکه شدن و جدا شدن نشانگر فلورسانس نوکلئوتید قبلی و آماده‌سازی انتهای ۳ برای نوکلئوتید بعدی است.
در روش¬های توالی یابی که اساس آن‌ها استفاده از خاتمه دهنده¬های دارای رنگ قابل‌برگشت است، در همه چرخه¬ها هر چهار نوکلئوتید حضور دارند. چهار نوکلئوتید شرکت‌کننده هرکدام بارنگ فلورسانس خاصی نشان‌دار شده¬اند. توالی یابی در این نوع از توالی یاب¬ها به‌صورت افزایشی و در هر مرحله با شرکت یک نوکلئوتید انجام می¬گیرد و این به خاطر گروه بلوکه کننده¬ای هست که در موقعیت ۳́ – OH قند¬های ریبوز وجود دارد و از افزودن نوکلئوتید‌های دیگر با پلی مراز جلوگیری می¬کند. درنتیجه سری حوادثی که در طول توالی یابی پیش می¬آید به ترتیب شامل این مراحل است:
۱٫ افزوده شدن نوکلئوتید با پلی مراز
۲٫ شستشوی نوکلئوتیدهای باقیمانده
۳٫ تصویر برداری فلو سل برای شناسایی مجموعه¬هایی که سیگنال فلورسانت را گزارش نموده¬اند
۴٫ برش شیمیایی گروه های فلورسانت و آزاد شدن انتهای ۳́ – OH برای اضافه شدن نوکلئوتید بعدی.
این مراحل تا اضافه شدن ۱۵۰ نوکلئوتید ادامه پیدا می¬کند، تا این‌که دومین مراحل آماده‌سازی خوانش¬ها آغاز گردد.

توالی یابی بر اساس سنتز با فن¬آوری Illumina

توالی یابی بر اساس سنتز با فن¬آوری Illumina

برای خوانش توالیها از انتهای مخالف هر مجموعه قطعات تولیدشده، دستگاه ابتدا رشته سنتز شده را با واسرشته سازی جدا می-کند و مجموعه¬ها را به‌صورت پل برای بهبود نسبت سیگنال به نویز در یک قطعه کوتاه ثانویه تکثیر می‌کند. پس از مرحله تکثیر، انتهای دیگر قطعات از سطح فلو سل ها با ماده شیمیایی دیگری جدا و آزاد می‌شود (بسته به گروه نشانگری که بر روی سازگار ساز برگشتی وجود دارد) و قطعات به پرایمر برگشتی متصل می¬شوند. به‌این‌ترتیب توالی یابی ادامه پیدا میکند.
همه مراحل فوق بر روی فلو سل در همان ناحیه انجام میگیرد و به دخالت افراد نیازی ندارد. بنابراین ارتباط موقعیتی از سمت ابتدایی (پیشرو) به سمت موقعیت بعدی (برگشتی) حفظ می‌شود و باعث تطبیق بسیار بالای جفت قطعات حاصله با ژنوم مرجع می‌شود.
همان طور که گفته شد به دنبال مراحل تکثیر، مرحله تصویربرداری خواهد بود که در آن هر مرحله شرکت باز در فلو سلها در سه قطعه ۱۰۰ –tile با یک ابزار اپتیک دارای تراکم مجموعه¬ای ۳۰۰۰۰ در هر tile انجام می¬گیرد. در مرحله تصویربرداری از بافر اسکن استفاده می‌شود که بر روی فلو سل¬ها اضافه‌شده و سیستم¬های اپتیک هر مسیر را در سل ها با واحد‌های تصویربرداری به نام tile اسکن می¬کنند.
پس از هر مرحله تصویربرداری، گروه بلوکه کننده انتهای ۳́ به‌صورت شیمیایی برداشته می‌شود تا این‌که رشته را برای پذیرش نوکلئوتید بعدی با استفاده از DNA پلی مراز آماده کند.
مراحل شرکت نوکلئوتید¬ها برای تکثیر ادامه پیدا می¬کند تا این‌که به تعداد مشخصی چرخه که توسط کاربر در سیستم تنظیمی دستگاه مشخص‌شده است، برسد. دستگاه مربوط امکان مشخص کردن طول خوانشی برابر ۳۵-۲۵ باز را فراهم می¬کند.
در پایان کار توالی یابی با سیستم Illumina، الگوریتم خاصی برای توالی‌های تکثیرشده به کارگرفته می‌شود. این الگوریتم، ارزش¬هایی کیفی برای هر خوانش دارد. علاوه بر این با دارا بودن الگو¬هایی برای کنترل کیفی در اطلاعات داده¬ای حاصل از Illumina در هر دور انجام‌شده، توالی‌های دارای کیفیت پایین را حذف می‌کند.

مراحل توالی یابی Illumina بر اساس اقدامات سنتزی

مراحل توالی یابی Illumina بر اساس اقدامات سنتزیمراحل توالی یابی Illumina بر اساس اقدامات سنتزی

مراحل توالی یابی Illumina بر اساس اقدامات سنتزی

مزایا و معایب سیستم Illumina
در فن‌آوری Illumina به دلیل این‌که واکنش نوکلئوتید¬های خاتمه دهنده رنگی قابل بازگشت بوده و با کارایی بالایی در واکنش شرکت نمی¬کنند، طول خوانش¬های حاصل از آن کمتر از روش Roche 454 می¬باشد. علاوه بر این در این روش توالی یابی به دلیل استفاده از پلی مراز تغییریافته و نوکلئوتید¬های خاتمه دهنده، خطا¬های جابجایی بازی بیشتری رخ می‌دهد.

اطلاعات حاصل از Illumina دارای خطاهایی هستند که به‌صورت کاهش صحت و با افزایش مراحل افزودن نوکلئوتید¬ها توصیف می‌شود. خطا¬هایی که پیش می¬آیند، بیشتر جایگزینی هستند که در آن نوکلئوتیدی که شباهت با باز موجود در مجموعه دارد در ساختار در حال تکثیر قرار می¬گیرد.

درصد خطای بسیاری از خوانش¬های حاصل از Illumina تقریباً ۵/۰ % در بهترین حالت است (یعنی یک خطا در هر ۲۰۰ باز). منابع اختلال موجود شامل موارد زیر است:
۱- افزایش تعداد قطعات، عاملی برای افت فازی و ایجاد خطا درروش Illumina است. افزایش تعداد قطعات می¬تواند به دلیل عدم دبلوکه شدن آن‌ها در چرخه¬های قبلی باشد. دلیل دیگر برای آن می¬تواند عدم وجود گروه بلوکه کننده و شرکت نوکلئوتید-های اضافی در ساختار رشته در حال سنتز باشد.
۲- اختلال فلورسانسی، که به دلیل برش ناقص نشانگر فلورسانس از چرخه قبلی پیش می‌آید.

یکی از مزایای استفاده از فن‌آوری Illumina این است که در مقایسه با روش¬های دیگر، می‌تواند توالی کل ژنوم (که شامل مناطق توالی تکراری و مناطق هموپلی مر است) را به بهترین صورت مشخص کند. این موضوع به دلیل توانایی این سیستم برای توالی یابی نوکلئوتید به نوکلئوتید آن با روش افزایشی می¬باشد.
طول خوانش ها از دستگاه های اولیه Solexa که توانایی خوانش قطعاتی ۲۵ جفت بازی را داشتند به دستگاه¬های امروزه رسیده است که توانایی آن‌ها خوانش قطعاتی ۱۵۰ جفت بازی است و Illumina HiSeq 2000 نام دارند. افزایش طول خوانش ها مربوط به انفجار عظیمی است که در ظرفیت دور دستگاه¬های حاصله در مدت‌زمان نسبتاً کوتاهی (۵ سال) اتفاق افتاده است و ظرفیت آن‌ها از ۱Gb برای نسل اول دستگاه¬ها به ۶۰۰ Gb در دستگاه¬های امروزی Illumina HiSeq 2000 رسیده است. این دستگاه¬ها قادر به تولید داده¬هایی کافی برای پوشش دادن کل توالی ژنومی انسانی در مدت‌زمان تقریبی ۱۱ روز هستند.

دلیل دیگر برای افزایش کارایی دستگاه¬های Solexa مربوط به توانایی آن‌ها برای استفاده از کتابخانه هایی است که باقابلیت بالایی به سطح فلو سل¬ها اتصال یافته اند و این عاملی برای افزایش چمشگیر در تراکم مجموعه¬های حاصل از تکثیر است. بهبود-هایی که در شیمی دبلوکه کردن قطعات و مراحل حذف فلورسانس به وجود آمده و باعث تکمیل شدن این مراحل شده است و همچنین مهندسی پلی مراز که باعث افزایش صحت نوکلئوتید‌های واردشده و کاهش خطا¬های مرتبط با دستگاه در مراحل تکثیر به‌صورت پل می‌شود دلیلی برای افزایش کارایی استفاده از فن‌آوری Illumina برای توالی یابی است.

Tags: , , , , , , , , ,


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

5 + دو =