فلوسایتومتری (Flow cytometry)

این تکنیک یک روش آنالیز زیستی است که بر همکنش ذرات را با نور اندازه گیری میکند و برای انالیز خصوصیات فیزیکی شیمیایی ذرات غوطه ور شده در یک سیال که از حداقل یک نور لیزر عبور می کنند استفاده می شود.سلول ها و اجزای ان جهت بررسی جمعیت سلولی و اجزای ان با مواد فلورسانت نشان دار شده و در حین عبور از مجرای تعبیه شده در دستگاه به وسیله نور لیزر برانگیخته می شود و پس از ان نور هایی با طول موج های مختلف ساطع میکند.اساس تفکیک سلول ها و اجزای یک جمعیت سلولی تفاوت در طول موج های ساطع شده است.
به طور کلی مفهوم لغوی فلوسایتومتری اندازه گیری سلول ها ی در جریان می باشد که البته با پیشرفت این تکنیک هر نوع ذره ای از نانوذره تا باکتری ها هم با کمک این دستگاه قابل ارزیابی هستند.
از جمله ویژگی هایی که به کمک فلوسایتومتری ارزیابی میشود:
۱- شمارش سلول ها
۲- جداسازی و طبقه بندی اجزای موجود در یک سوسپانسیون بر مبنای اندازه ، شکل ، فراوانی و پیچیدگی های داخل ذرات
۳- شناسایی بیومارکر های سلولی
۴- شناسایی انواع متغیر پروتئین های سطح سلولی که از این طریق در مبحث مهندسی پروتئین مطرح می شود.
در این تکنیک مخلوطی از انواع سلول ها یا ذرات به صورت سوسپانسیون در امده و تک به تک از مقابل یک یا چند نور لیزر عبور می کنند و طی این عبور بسته به اینکه ذرات با چه ماده ی فلورسنتی label دار شده اند نور هایی طول موج های متغیراز خود ساطع می کنند که این طول موج ها توسط دستگاه ثبت میشود.در این راستا یک فلوسایتومتر از اجزای زیر تشکیل شده است:

۱- سیستم Fluidics:

این سیستم مسئول انتقال ذرات در قالب یک جریان سیال به سمت پرتوی لیزری در راستای شناسایی و بررسی می باشد.این سیستم با کم کردن فشار از روی مخزن محتوی مایع محتوی سلول سبب جریان سازی سلول ها میشود، به دنبال کم شدن تدریجی فشار سلول ها به ارامی به سمت بالا جریان پیدا کرده و وارد اتاق integration می شوند.
هدف مهم این سیستم برقراری جریان در سیال در راستای قرارگیری ذرات در مرکز نور لیزر است زیرا برای انالیز در هر ثانیه فقط یک سلول یا ذره باید از جلوی نور لیزر عبور کند.در این راستا سوسپانسیون نمونه ها باید به داخل یک سیال نمکی تحت عنوان Sheath Fluid تزریق شوند حال با توجه به نحوه ی طراحی دستگاه نمونه ها در مرکزسیال متمرکز میشوند تا نور لیزر با هر ذره عبوری به صورت جداگانه برهمکنش ایجاد کند.

۲- سیستم Optics:

این قسمت از دستگاه شامل لیزر های متنوع جهت برانگیختگی ذرات در سیال می باشد.از سوی دیگر فیلتر های Optical در این قسمت از دستگاه تعبیه شده است تا سیگنال های نوری ایجاد شده را به سمت دیتکتور های مناسب هدایت نماید.
هر دستگاه فلوسایتومتر فقط یک نوع لیزر را پشتیبانی می کند.داشتن اگاهی از نوع لیزر دستگاه برای انتخاب نوع فلوئوفور ضروری است زیرا طول موج برانگیختگی فلوئوفور ها باید در محدوده ی لیزر باشد.
انواع مختلف لیزر شامل UV (با طول موج ساطع شده بین ƛ۳۵۵ تا ۳۶۰ƛ) ، Violet ( طول موج ۴۰۵) ،Blue ( طول موج ۴۸۸)، Yellow (طول موج ۵۶۱) ، Green ( طول موج ۵۳۲) و Red ( طول موج ۶۳۳) می باشد که در بین انها UV بیشترین انرژی و کمترین طول موج و Red کمترین انرژی و بیشترین طول موج را دارد.
فیلتر های optical شامل لنز های جمع اوری برای متمرکز کردن نور های ساطع شده از بر همکنش لیزر با ذره و نیز یک سیستم از اینه های اپتیکال و فیلتر هایی برای هدایت امواج نور های جمع اوری شده به سمت قسمت دیتکتور دستگاه می باشد.

۳- سیستم Electronics :

قسمتی از دستگاه می باشد که مسئول انالیز سیگنال های نوری ساطع شده و تبدیل انها به امواج الکتریکی می باشد که این امواج به صورت نمودار های مختلف قابل انالیز هستند.

بسته به اینکه ازمایش چه هدفی را دنبال می کند سلول نیاز به رنگ امیزی دارد.اگر هدف از ازمایش بررسی پارامتر هایی چون اندازه ذره و یا بررسی پیچیدگی های داخل ان باشد نیازی به رنگ امیزی ذره نیست و تنها ذرات به صورت سوسپانسیونی به sheath Fluid تزریق شده و از مجرای برخورد با لیزر عبور میکند ( حالت Light Scattering) اما اگر هدف بررسی بیومارکر های سطح سلول و یا بررسی اجزای داخل ذره و خصوصیات ان و یا جداسازی انواع مختلف سلولی باشد نیاز است که از روش های رنگ امیزی و Gating استفاده کنیم . در روش Gating انتی بادی های متصل به فلوئوروکروم استفاده می شود.( حالت Emission of Light)

الف. در حالت Light Scattering با دو نوع مختلف عبور نور مواجه هستیم.
۱- (Forward Scatter Light (FSC: بخشی از نور است که در پی برخورد با ذره به سمت بالا و پایین هدایت میشود. منظور نوری است که بعد از برخورد با ذره به مستقیم و موازی با محور لیزر به راه خود ادامه می دهد و توسط دیتکتور ها در راستای مستقیم شناسایی میشود.اطلاعات مربوط به FSC انداره و و خصوصیات سطحی ذره را مشخص می کند.
۲- (Side Scatter Light (SSC: بخشی از نور است که در پی برخورد با ذره به اطراف منحرف شده و نسبت به محئر نور لیزر زاویه ۹۰ درجه پیدا میکند. اطلاعات مربوط به SSC میزان پیچیدگی و محتوای داخل ذره را مشخص میکند.
داده های فلوسایتومتری در این زمینه به صورت یک List mode ارائه میشود که ستون اول ان مربوط به شماره ی سلول ، ستون دوم FSC و ستون سوم SSC می باشد. پر واضح است که همه ی ذرات یه سوسپانسیون از یک نوع باشد اعداد FSC و SSC مشابه هم خواهد بود و با انالیز داده های دستگاه می توان جمعیت های مختلف از ذرات را از هم تشخیص داد.
دستگاه بر اساس داده های List mode نمواداری رسم میکند که محور x ان مربوط به FSC و محور y ان مربوط به SSC می باشد.اعداد در نمودار به صورت نقطه نمایان می شوند. ( ۲D scatter plot)

اماده سازی سوسپانسیون در مرحله تریپسینه کردن قبل از وارد کردن به دستگاه بسیار مهم است زیرا سلول ها باید کاملا از هم جدا باشند و از طرفی نباید ساختار و مرفولوژی خود را ازدست بدهند از این رو بهتر است زمان تریپسینه کردن را کاهش بدهیم و بیشت از ضربات فیزیکی برای جداسازی ذرات از کف فلاسک استفاده کنیم.
از سوی دیگر باید دقت کنیم سلول ها الوده به باکتری و قارچ نباشند در این راستا باید سلول ها قبل از تریپسینه شدن به خوبی با PBS شسته شوند.

ب. در روش های مبتنی به رنگ امیزی ، هدف بررسی اجزای داخل سلول ، هسته و تشخیص سلول های مرده از زنده می باشد.در این حالت لازم است که ابتدا سلول ها را با موادی همچون فرمالدئید fix کرده و با استفاده از رنگ های مبتنی بر هدف ازمایش انها را رنگ امیزی کنیم.لازم به یاداوری است که باید دقت شود ماده ای که با ان سلول یا بافت را fix می کنیم با فلوئوفور مورد استفاده سازگار باشد.
برای رنگ هایی که راحت از غشای سلول زنده عبور می کنند نیازی به fix کردن سلول یا بافت نیست اما برای رنگ هایی که به راحتی از غشا عبور نمیکنند لازم است که ابتدا سلول یا بافت مرده و fix باشد.چند فلوئوفور رایج برای رنگ امیزی سلول ها عبارتند از: DAPI و Hoechst که به راحتی وارد سلول زنده می شوند و در اثر بر انگیختگی از خود نور با رنگ های متفاوت مثل ابی ساطع می کنند حال انکه رنگ های PI و اتیدیوم بروماید به راحتی از غشا عبور نمی کنند و برای استفاده از انها باید حتما سلول ها مرده و فیکس شوند.
بعد از فیکس سلول ها و رنگ امیزی ، سلول ها را تریپسینه کرده و بعد از کنده شدن با FBS اثر تریپسین را خنثی کرده سپس با سانتریفوژ مایع رویی را دور ریخته سپس به رسوب PBS به همران اندکی FBS یا BSA اضافه کرده و با دستگاه انالیز می کنیم.

در شرایطی که از مواد فلوئوفور استفاده میکنیم باید علاوه بر اگاهی از نوع لیزر دستگاه نوع فیلتر دستگاه را نیز بدانیم زیرا انواع محتلفی از فیلتر ها برای شناسایی طول موج های مختلف وجود دارند و peak طول موج گسیل شده از فلوئوفور باید در محدوده ی شناسایی فیلتر باشد.
انواع فیلترها:
Long pass: از طول موج ۵۲۰ با بالا را شناسایی می کند و بیشتر برای ازمایش هایی مناسب است که یک نوع رنگ بیشتر نداریم.
By pass: طول موج های بین ۵۲۰ تا ۵۴۰ را شناسایی می کند.
Short pass: فقط طول موج های ۴۶۰ƛ را شناسایی می کند.
Dichoric Filter: نوعی فیلتر است که طول موج ۵۴۰ را شناسایی می کند.این فیلتر زاویه ی تقریبا ۴۵ درجه دارد اما ماهیت کارکرد ان مشابه بقیه فیلتر ها می باشد.

در صورتی که هدف بررسی DNA و محتویات هسته باشد از رنگ امیزی مستقیم با مواد ذکر شده استفاده می کنیم اما اگر هدف بررسی محتویات سیتوپلاسم ، مارکر های سطح سلولی و جداسازی انواع مختلف سلول ها از یک جمعیت هتروژن باشد باید از انتی بادی های متصل به فلوئوروکروم استفاده کرد که این اتصال می تواند مستقیم و یا غیر مستقیم ( اتصال انتی بادی ثانویه متصل به فلوئوروکروم به انتی بادی اولیه مکمل با انتی ژن های سطح سلول) باشد.
فلوئوروکروم ها ترکیبات فلورسنتی هستند که میتوانند از طریق اتصال به انتی بادی ها به اجزای مختلف ذره ی هدف متصل شوند. شدت فلورسنت ساطع شده متناسب با جایگاه های اتصال یافته است.
از پرکاربرد ترین فلوئوروکروم های مصرف شونده می توان به (Fluorescein Isothiocyanate( FITC ( سبز رنگ)، (Phycoerythrin(PE ( نارنجی رنگ)، (Allophycocyanin (APC و Texas reid اشاره کرد.
رنگ امیزی نمونه ها با فلوئوفور ها شدت بیان هر کارکر را نیز نشان میدهد؛ هر چه تعداد بیشتری فلوئوفور به انتی ژن مربوطه متصل شود شدت نور ساطع شده بیشتر خواهد بود و نشان می دهد که مارکر مربوطه بیان بالایی در سلول داشته است.
باید دقت شود که در صورتیکه انتی ژن های مورد نظر سطح سلول کم هستند از انتی بادی غلیظ و فلوئوفور پر رنگ تر استفاده شود و در صورتیکه انتی ژن های سطح سلول زیاد هستند انتی بادی ها رقیق گشته و از فلوئوفور های کم رنگ (رنگ های روشن) استفاده کنیم.
نحوه ی نمایش داده های فلوسایتومتری به طرق زیر می باشد:
۱- نمودار هیستوگرام
۲- Dot plot
۳- Density plot
نقاط در نمودار Dot plot سیاه رنگ و در Density plot رنگی هستند.
اطلاعات در نمودارDensity plot و Dot plot معمولا به سه حالت هستند: ۱- نمودار نحوه ی توزیع سلول ها بر اساس سایز و پیچیدگی های داخل سلول ( FSC vs SSC) 2- نمودار بیان یک مارکر در سطح و یا داخل سلول ( Single color vs side scatter) 3- مقایسه ی بیان دو مارکر مختلف در سطح و یا داخل سلول ( Two color fluorescence plot)
در نمودار Density plot جایگاه های متراکم تر سلولی هم مشخص می شود که می توان با انتخاب اون نواحی در نمودار انالیز ها را محدود به نواحی متراکم نمود؛ پس در این مدل نموداری می توان subpopulation ها را نیز مشخص کرد.

flowcytometry
(Fluorescence Activating Cell Sorting (FACS:
این روش، روشی کارامد برای جداسازی جمعیت های مختلف سلولی از یک جمعیت هتروژن مانند cell culture و یا نمونه های خونی و غیره است. از سوی دیگر با کمک این تکنیک می توان اجزای مختلف درون سلول از جمله هسته و یا کروموزوم را نیز جدا نمود. از ویژگی های دیگر این تکنیک ایجاد خلوص بالا در جمعیت های جدا شده می باشد.
مراحل FACS تقریبا مشابه فلوسایتومتری می باشد اما در انتها برای جدا سازی جمعیت های مورد نظر، ذرات باردار شده و از طریق قرار گرفتن در میدان الکتریکی از یکدیگر جدا شده و نهایتا بصورت جداگانه جمع اوری می شوند.
در صورتی که هدف جداسازی یک جمعیت خاص سلولی از یک جمعیت هتروژن باشد، باید با کمک انتی بادی های مخصوص انتی ژن های سطحی جمعیت سلولی مورد نظر که با رنگ فلورسنت خاصی نشاندار شده اند رنگ امیزی شوند ؛ در اینصورت پس از قرار گرفتن در ماده ی سیال دستگاه به صورت قطره های حاوی تنها یک سلول از مقابل نور لیزر عبور می کنند و بر اساس رنگی که به انها متصل شده است طول موج مشخصی از خود ساطع می کنندکه توسط دیتکتور ها شناسایی میشود. در مرحله ی بعد هر قطره که حاوی یک سلول مجزا است باردار شده و وارد صفحات جدا کننده می شود و بر حست نوع بار خود در ویال های جداگانه جمع اوری می گردد.در این مرحله قطره هایی که حاوی سلول نیستند و نشاندار نشده اند در تیوپ های زباله جمع اوری میشوند.در پایان ازمایش تعداد سلول های موجود در هر ویال و میان فلورسانت ساطع شده از هر سلول ثبت می کردد.

FACS

مزایای فلوسایتومتری:
۱- با کمک این دستگاه می تواند همزمان چندین ویژگی در سلول از جمله اندازه ، پیچیدگی و یا خصوصیات فیزیکی و شیمیایی از جمله بیان مارکرهای اختصاصی در سلول ها را ارزیابی کرد.
۲- می توان جمعیت های خاص سلولی را از یک جمعیت هتروژن جداسازی نمود.
۳- می توان در یک زمان تعداد زیادی از سلول ها را از لحاظ زنده و یا مرده بودن انالیز کرد.
۴- می توان سلول ها را بر اساس خصوصیات فیزیکی و شیمیایی خاص از هم جدا نمود.

معایب فلوسایتومتری:
۱- مراحل قبل از انجام فلوسایتومتری مانند فیکس کردن بافت و یا سلول تا حدودی زمانبر است.
۲- پیش تیمار سلول ها با مواد رنگی و فلوئوفور تا حدودی وقت گیر بوده و نیاز به تبحر بالا دارد.
۳- تجمع مواد زائد می تواند در جواب نهایی گزارش کاذب ایجاد کند.
۴- با توجه به نیاز به انتی بادی و رنگ امیزی روشی نسبتا پرهزینه است.
۵- انجام ازمایش تا حدودی سخت بوده و نیاز به تکنسین با تجربه دارد.

print
Tags: , , , ,


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

3 + 7 =