تکنیک ( Chromatin immunoprecipitation Sequencing (ChIP-Seq

از جمله تکنیک های کارامد در راستای کشف و بررسی مناطق اتصال پروتئین به ژنوم می باشد. با توجه به اهمیت میانکنش بین پروتئین های متصل شونده به DNA با ژنوم در شکل گیری و اغاز بسیاری از مسیر های حیاتی داخل سلول از جمله همانند سازی ، رونویسی و ترمیم و در نتیجه تنظیم رخدادهایی چون رشد و تکثیر و تمایز سلولی ، مطالعه و شناسایی مناطقی از ژنوم که جایگاه اتصال پروتئین های هدف می باشند کمک شایانی به رفع  ابهامات مبتنی بر نحوه ی تنظیم بیان ژنها ، کنترل رخداد های مسیر های سلولی و نحوه ی ایجاد فنوتیپ بیماری ها می کند.

تکنیک ChIP-seq در واقع تلفیقی از دو روش کارامد Chromatin immunoprecipitation و توالی یابی ( Next Generation Sequencing)  می باشد.

در این روش ابتدا نواحی از ژنوم که به صورت مستقیم و فیزیکی با پروتئین های فاکتورهای رونویسی و یا سایر پروتئین های متصل شونده به کروماتین میانکنش دارند توسط تکنیک Chip جدا سازی شده و سپس به کمک تکنیک های توالی یابی و با کمک توالی های مرجع انالیز می گردند. از سوی دیگر با کمک این تکنیک نه تنها الگوی میانکنش پروتئین ها با DNA شناسایی میشود بلکه الگوی تغییرات اپی ژنتیکی اعمال شده به ساختار کروماتین ها نیز بررسی می گردد.

مراحل انجام واکنش:

مرحله ی ChIP : 

۱- افزایش میزان میانکنش پروتئین هایی چون فاکتورهای رونویسی و هیستون ها  با توالی ژنوم به کمک موادی چون فرمالدئید ( مرحله cross link )

هدف از این مرحله جلوگیری از جدا شدن پروتئین ها از ژنوم به دنبال لیز سلول و شکست کروماتین می باشد.

۲- لیز سلول و شکست کروماتین با کمک روش هایی چون سونیکاسیون (X-ChIP ) و یا micrococcal nuclease (N-ChIP)

۳- رسوب پروتئین ها با استفاده از انتی بادی های مخصوص پروتئین های هدف ( مرحله ی immunoprecipitation)

۴- کاهش میزان تمایل پروتئین به توالی برای جداسازی پروتئین ها از ژنوم و خالص یسازی ژنوم

مرحله ی Next Generation Sequencing

۱- جداسازی قطعات DNA بر اساس اندازه  ( بهترین طول برای توالی یابی در حدود ۱۰۰-۵۰۰ bp می باشد)

۲- اتصال اداپتور های الیگونوکلئوتیدی

۳- انجام توالی یابی  با پلتفرم Illumina

۴- انالیز بیوانفورماتیکی داده های حاصل از توالی یابی

تکنیکSequencing Chromatin immunoprecipitation (ChIP-Seq)مزایای استفاده از روش ChIP-Seq :
۱- امکان شناسایی مناطق اتصال فاکتور های رونویسی و پروتئین های تغییر دهنده ی هیستون ها در ژنوم کلیه ی اورگانیسم ها.
۲- مشخص کردن جایگاه های اتصال های پروتئین های تنظیمی دخیل در مسیر های حیاتی سلول از جمله همانند سازی ، رو نویسی و …
۳- امکان شناسایی نواحی رونویسی و تنظیمی جدید در ژنوم
۴- عدم نیاز به دانش قبلی در زمینه توالی هدف در راستای ساختن پروب های مکمل با توای ( روش ChIP- chip )
۵- دسترسی به یک پروفایل جامع ژنی از چندین نمونه به صورت همزمان در راستای کاهش هزینه و بالا رفتن دقت کار.
۶- امکان طراحی شبکه ی جامع تنظیمی به صورت مشترک با داده های حاصل انالیز های RNA seq و Methylomics

نکته: از همین تکنیک میتوان برای شناسایی جایگاه های اتصال پروتئین به RNA ها نیز استفاده کرد که در ان صورت با نام
RNA-immunoprecipitation (RIP)- seqشناخته می شود. این تکنیک را می توان با مرحله ی cross linking و یا بدون ان انجام داد. انجام این تکنیک بدون مرحله ی cross link قادر به شناسایی میانکنش های گذرا در بین پروتئین با RNAها نیست و دقت کار را پایین می اورد. بدلیل متحرک بودن RNA ها مرحله ی cross link در RIP-seq بسیار حائز اهمیت است بهمین دلیل از ultraviolet cross linking استفاده می کنند تا دقت کار بالاتر برود.

print
Tags: ,


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

هجده + دوازده =