ویرایش ژنوم (ایجاد تغییرات هدفمند در ژنوم موجودات زنده)

رویکرد کلی در تحقیقات مدرن زیست‌شناسی به‌این‌ترتیب است که با دست‌کاری توالی ژنتیکی (ژنوتیپ) یک موجود زنده و یا یک تک‌سلولی، اثرات تغییر اعمال‌شده در فنوتیپ آن موجود بررسی می‌شوند. به چنین رویکردی ژنتیک معکوس(. reverse genetic) می‌گویند. این روش به دلیل سادگی نسبی در اجرا و نتایج حاصل از آن، در زیست‌شناسی جدید اهمیت زیادی پیداکرده است. برخلاف ژنتیک معکوس ، در ژنتیک پیش رو( forward genetic) ابتدا یک فنوتیپ جدید مشاهده می‌شود و سپس اساس ژنتیکی آن مطالعه می‌شود. در این رویکرد به دلیل آن‌که تغییرات فنوتیپی اغلب نتیجه اندرکنش‌های چندگانه ژنتیکی است، زمان زیادی برای بررسی‌ها و غربال فنوتیپ موردنظر صرف می‌شود. البته این شاخه قدیمی‌ترین زمینه مطالعاتی در علم ژنتیک را فراهم آورده و پیشینه آن به آزمایشات گریگور مندل برمی‌گردد. مندل در جست‌وجوی بنیان و نحوه عمل “وراثت” بود. کشف کلیدی ژنتیک کلاسیک در یوکاریوت ها پدیده پیوستگی ژنتیکی بود. به‌نحوی‌که بعضی ژن‌ها به‌صورت پیوسته به هم تفکیک‌شده و به ارث می‌رسند. طبق آزمایشات انجام‌شده معلوم گردید در تقسیم میوز قانون وراثت مندلی (تفکیک متجاوز) شکسته می‌شود و در ادامه راهی را فراهم می‌آورد که به‌واسطه آن بتوان نقشه صفات موجود زنده را به موقعیت خاصی از کروموزوم نسبت داد. این نقشه‌ها بیشترین کاربرد را در اصلاح گیاهان و دام و طیور داشته‌اند و به کمک آن‌ها تغییرات فراوانی در کمیت و کیفیت این محصولات به وجود آمده است. در ژنتیک کلاسیک، یک ژن ، به‌عنوان واحد وراثت شناخته می‌شود که با یک ویژگی خاص مرتبط است. در اینجا اساس مولکولی ژن و ماهیت آن مطرح نیست بلکه صرفاً به‌عنوان یک “عامل وراثت” در نظر گرفته می‌شود. در ژنتیک کلاسیک، یک صفت یا ویژگی به ژن‌های مختلفی نسبت داده می‌شود که به حالت‌های مختلف یک ژن “آلل” گفته می‌شود. در بعضی موارد، دو آلل در موجود مسئولیت بروز صفات رادارند. مجموعه‌ای از آلل‌ها که صفت یا صفات فرد را کنترل می‌کنند ژنوتیپ نامیده می‌شود. بعد از انجام تحقیقات متعدد توسط دانشمندان در آزمایشگاه‌های مختلف معلوم گردید عامل وراثت DNA است. سپس جیمز واتسون و فرانسیس کریک با ارائه مدل مارپیچ دوگانه این ماده وراثتی را برای دیگران تجسم پذیر نمودند. در ادامه مسیر، فرانسیس کریک “قضیه مرکزی “(central dogma) را مطرح نمود و نحوه گردش اطلاعات و استفاده از آن را در موجود زنده توجیه نمود و این بار نیز فصل جدیدی از درک فرایندهای سلولی گشوده شد. اما تأثیرگذارترین کشف علمی بر تحقیقات حال حاضر، فناوری DNA نوترکیب است که توسط استنلی کوهن و هربرت بویر در سال ۱۹۷۲ ارائه گردید. بعد از آن تاریخ بود که دانش ژنتیک به‌صورت جدی و کاربردی در صنعت، کشاورزی، محیط‌زیست، پزشکی و… راه پیدا کرد. همچنین، این فناوری سبب ارائه راه‌حل‌هایی برای توالی یابی کل ژنوم، ایجاد جهش‌های دقیق در ژنوم، حذف و اضافه نمودن یک قطعه از توالی ژنوم، کشف فرایندهای سلولی (که در ژنتیک مندلی یا قابل‌تصور نبود و یا بسیار مشکل می‌نمود)، مطالعه تغییرات اپی ژنتیکی و بسیاری موضوعات دیگر گردید. به‌طور خلاصه این فناوری سبب درک بهتری از گذشته تکاملی موجودات زنده شده و برای آینده نیز افق‌های بسیار روشنی جهت حل مسائل زیست‌شناسی ترسیم نموده است. در آستانه‌ی قرن بیست و یکم، مقیاس کاربردهای این فناوری همانند روزهای اولیه خود نیست. بدون شک، پیشرفت‌های شگرفی حاصل‌شده بطوریکه امروزه حتی از ویرایش و مهندسی ژنوم نیز صحبت به میان می‌آید. حتی ممکن است در آینده‌ای نزدیک شاهد تغییرات کیفی دیگری باشیم که امروز تصور آن برای ما غیرممکن باشد.

در مطلب حاضر سعی براین است تا ویرایش و مهندسی ژنوم به‌عنوان روش‌های نوین در مهندسی ژنتیک معرفی گردند. در اینجا انواع مکانیسم‌های درون سلولی برای شکست و اتصال ژنوم و کاربردهای آن در ویرایش ژنوم و روش‌های نوین ویرایش ازجمله کاربرد مولکول‌های نوترکیب ZFN،TALEN، CRISPR و … موردبحث قرار می‌گیرند.

با توسعه روش‌های جدید برای توالی یابی کامل ژنوم و پروژه‌های طراحی و تفسیر ژنوم های بزرگ، دانشمندان به دنبال انتقال دانش‌پایه تکامل ژنوم به سمت دانش‌های کاربردی هستند. بنابراین تبدیل این داده‌های فراوان به دانش کاربردی و بالینی موردتوجه بوده و راه گشا خواهند بود. نکته مهم در این مورد این است که “روش‌های مناسب و مؤثری” نیاز است تا محقق به کمک آن‌ها بتواند رابطه بین ژنوتیپ و فنوتیپ را درک کند.
نوترکیبی همتا روشی قوی برای غیرفعال سازی یا درج هدفمند ژن موردنظر می‌باشد که سبب فراهم آوردن داده‌های ارزشمندی از عملکرد ژن می‌شود. البته استفاده از این روش با چند فاکتور محدود می‌شود. در این روش کارایی سازه‌های مهندسی‌شده برای درج صحیح در محل کروموزومی موردنظر پایین است. این کار زمان‌بر بوده و به نیروی انسانی و به راهبردهای غربالگری/گزینش حساس بوده و پتانسیل ایجاد جهش‌های بد را دارد. از طرف دیگر ناک داون کردن ژن موردنظر توسط RNAi ، که امروزه بسیار پرکاربرد است دارای مزیت‌هایی همچون سریع عمل، ارزانی فرآیند و کارایی بالا نسبت به نو ترکیبی همتاست. هرچند ناک داون کردن با RNAi ناکامل است، بین دو آزمایش یکسان در دو آزمایشگاه مختلف نتایج تغییر می‌کند و اثر بر روی ژن‌های غیر هدف غیرقابل‌پیش‌بینی بوده و تنها سبب بازدارندگی عملکرد ژن موردنظر می‌شود.
ویرایش ژنوم
تغییر اختصاصی و هدف‌گیری شده در اطلاعات زیستی موجود زنده را ویرایش ژنوم می‌نامند. طبق این تعریف و توضیحات پیشین، روش‌های رایج حذف یا درج ژن در ژنوم معمولاً نگرانی‌ها و معایب زیر را ایجاد می‌کنند:
۱) ‌ درج تصادفی و کورکورانه ژن
۲) غیرفعال سازی و تخریب عمل دیگر ژن‌ها
۳) ایجاد عوارض ناخواسته مثل سرطانی شدن سلول‌ها
۴) عدم تضمین درج ژن در یک مکان مشابه در دو سلول متفاوت
۵) عدم تضمین در قابلیت انتقال به نسل بعد
این محدودیت‌ها سبب می‌شود که محققان نتوانند ژنوتیپ را به فنو تیپ به‌طور مستقیم ربط دهند. با ظهور دوره ویرایش ژنوم رویکرد جدیدی ایجادشده است که دست ورزی هر ژنی در طیف وسیعی از انواع سلول‌ها و موجودات را ممکن می‌سازد. ویرایش ژنوم فناوری بنیادی است که در آن انواع پروتئین‌های متصل شونده به DNA (مثل فاکتورهای رونویسی و…) مهندسی‌شده و در پیوند با دیگر پروتئین‌هایی که بر DNA اثر دارند (مثل نوکلئاز ها، ریکامبینازها، متیلاز ها ، فعال‌کننده‌های رونویسی ، هیستون استیل ترانسفرازها و…) سبب تغییر در جایگاه ویژه‌ای از ژنوم خواهند شد.
نکته اصلی در ویرایش ژنوم “تشخیص جایگاه هدف ” می‌باشد. این وظیفه توسط دامنه‌های پروتئینی که در شرایط طبیعی به DNAمتصل می‌شوند انجام می‌شود. در این میان پروتئین انگشت روی( zinc finger) و TALEها(Transcription Activator Like Effectors) از اهمیت خاصی برخوردارند. از طرف دیگر در سال‌های اخیر روش CRISPR که سیستم دفاعی در باکتری‌ها و آرکئی ها محسوب می‌شود در ویرایش ژنوم به کار گرفته‌شده است. اساس تشخیص ویرایش در این روش با نحوه عمل انگشت روی و TALEها متفاوت است.

برای درک بهتر نحوه عمل سیستم‌های ویرایش ژنوم اصطلاحات پرکاربرد در زیر آورده شده‌اند.
ترمیم بر اساس همتائی HDR
پس از اثر شرایط محیطی همچون مواد شیمیایی و پرتوهای جهش‌زا و یا مولکول‌های برش دهنده DNA، (به‌عنوان نمونه نوکلئاز مهندسی‌شده مدنظر محقق که در جایگاه ژنومی خاص عمل می‌کند) سیستم سلولی برای ترمیم ناحیه آسیب‌دیده، با فراهم آوردن یک الگوی دارای همتائی کروموزومی مناسب (یا همان HDR) عمل بازسازی را انجام می‌دهد. سیستم HDR به‌خوبی می‌تواند DNA را ترمیم کند. در این شرایط می‌توان از فرصت ایجادشده استفاده نموده و مولکول دهنده (DNA خارجی) را در همان محل درج نمود. این روش برای درج‌های چندگانه و یا تکی، همانند جایگزینی تک نوکلئوتیدی صورت می‌گیرد.
اتصال دو انتهای ناهمتا یا NHEJ
این مسیر ترمیم سلولی همانند روش HDR یک روش‌ترمیم DNA محسوب می‌شود که پس از ایجاد شکست در دو رشته DNA ( DSB) توسط نوکلئازها آغاز می‌شود. برخلاف مسیر HDR، در این مسیر از الگوی همتا برای تعمیر استفاده نمی‌شود و فقط دو انتهای برش یافته به همدیگر متصل می‌شوند. بنابراین، به‌طور مشخص درج‌ها و یا حذف‌های کوچکی را در محل شکستگی ایجاد می‌کند که در اغلب موارد سبب تغییر در چارچوب قرائت‌شده و عمل ژن متوقف می‌شود.
تصویر کلی از ویرایش ژنوم با استفاده از نوکلئازهای مکان ویژه:
بعد از کشف اینکه شکاف در دو رشته (DSB) فراوانی‌ترمیم بر اساس همتایی را افزایش می‌دهد، چندین روش برای بهبود کارایی تغییرات ژنتیکی ارائه شد. به‌عنوان‌مثال، با انتقال هم‌زمان پلاسمید بیان‌کننده‌ی نوکلئاز که جایگاه ویژه‌ای را برش می‌دهد با یک پلاسمید دهنده‌ای که دارای بازوهای همتا با جایگاه برش یافته است، می‌توان یک یا چند ژن را به‌طور مؤثری در محل موردنظر درج نمود. همچنین با توالی‌های دهنده خطی با طول کمتر از ۵۰ جفت باز همتایی می‌توان جهش، حذف و یا درج را در جایگاه هدف القا کرد. در این روش تلفیق DNA به‌واسطه همتایی با آن محل خاص صورت می‌گیرد.
بنابراین اثر موقعیت که معمولاً در روش‌های دیگر مانع اعمال تغییرات می‌شود از بین می‌رود و در این موضوع، محقق را قادر می‌سازد که روابط ساختار-عملکرد در محیط پیچیده کروموزمی را مطالعه کند. همچنین، این نوکلئازها اجازه می‌دهند تا رده‌های سلولی یا موجودات تراریخته با فنوتیپ خنثی به‌سرعت تولید شوند. مزیت دیگر این نوکلئازها القا در حذف شدن قطعه بزرگی از کروموزم، جابجایی و یا ایجاد وارونگی ها می‌باشد. از طرفی می‌توان با برش هم‌زمان DNA کروموزمی هدف و DNA دهنده، قطعاتی با طول بیش از ۱۴ کیلو باز از طریق مکانیسم اتصال دو انتهای غیر همتا (NHEJ) انتقال داد.

شکست dna دورشتهپس از شکست در دو رشته، فعالیت‌های سلولی مهمی برای ترمیم محل آسیب‌دیده انجام می‌شود. ترمیم بر اساس همتایی کروموزومی و اتصال دو انتهای ناهمتا راهبردهای اصلی‌ترمیم می‌باشند. حدفاصل بین شکست DNA و ترمیم آن فرصت مناسبی برای درج، حذف، ایجاد وارونگی ، جابجایی و … می‌باشد.

ویرایش ژنوم با انگشت روی( Zinc Finger)
مولکول انگشت روی در شرایط طبیعی از ساختارهای اصلی اتصال به DNA به‌حساب می‌آید. این مولکول در پروتئین‌های تنظیم‌کننده بیان ژن ازجمله فاکتورهای رونویسی به‌وفور یافت می‌شود و انتهای کربوکسیل پروتئین DNAهدف را تشخیص می‌دهد. هر انگشت روی ۳۰ آمینواسید دارد که به‌صورتαββ روی همدیگر تا می‌خورند و با کلاته شدن یون روی توسط بنیان‌های حفاظت‌شده Cys2-His2 پایدار می‌شوند شکل(۲-۳). موتیف های انگشت روی با درج مارپیچ آلفای خود در شیار بزرگ مولکول DNA به آن متصل می‌شوند. هر انگشت به سه باز DNA به‌عنوان سوبسترا متصل می‌شود. اسیدهای آمینه کلیدی در موقعیت‌های ۱-،۱+،۲+،۳+،۴+،۵+،۶+ (نسبت به شروع مارپیچ آلفا در هر موتیف ) بیشترین کمک را در اندرکنش با توالی اختصاصی DNA دارند.
دامنه His2 – Cys2 انگشت روی، یکی از انواع معمول موتیف های متصل شونده به DNA است که در یوکاریوت ها یافت می‌شود و دومین پروتئین رمز شونده در ژنوم انسان ازنظر فراوانی است. یک انگشت روی منفرد تقریباً شامل ۳۰ آمینواسید است که ساختمان فضایی ββα حفظ‌شده‌ای را نشان می‌دهد.

ویرایش ژنوم با انگشت رویساختار دوبعدی(سمت چپ) و سه‌بعدی (سمت راست) مولکول انگشت روی. همان‌طور که ملاحظه می‌شود، اسیدهای آمینه‌های سیستئین و هیستیدین به همراه یون روی در تشکیل ساختار سه‌بعدی این مولکول نقش اساسی دارند.

معمولاً چندین آمینواسید آن در سطح با سه جفت باز در مارپیچ بزرگ DNA اتصال پیدا می‌کند. قالب ساختاری پروتئین انگشت روی، این مولکول را برای طراحی پروتئین‌های متصل شونده به یک DNA خاص، جذاب ساخته است. نکته کلیدی تشخیص یک DNAتوالی ویژه، استفاده از آرایه‌ای متشکل از حداقل سه انگشت روی است. این پیشرفت با کشف ساختار توالی‌های اتصال‌دهنده‌ای که فوق‌العاده حفظ‌شده‌اند صورت گرفته است. این ساختار، پروتئین‌های انگشت روی را قادر می‌سازد تا توالی‌های DNA 9 تا ۱۸ جفت باز را تشخیص دهد درحالی‌که چارچوب کلی مولکول همچنان محفوظ بماند.

مولکول انگشت روی هر مولکول انگشت روی می‌تواند سه باز را تشخیص دهد(بالا). بااتصال مولکول‌های انگشت روی به همدیگر می‌توان یک توالی نوکلئوتیدی ویژه در سطح ژنوم را شناسایی نمود(پایین)

ZFNیک موتیف انگشت روی(ZF) و توالی تشخیصی آن در شکل(A) آمده است. همان‌طور که ملاحظه می‌شود یک انگشت روی سه نوکلئوتید را شناسایی می‌کند. بنابراین می‌توان با کنار هم قرار دادن انگشت روی، موتیف های اختصاصی در سطح ژنوم را تشخیص داد(B). در C و D اندرکنش اسیدهای آمینه با بازهای آلی روی رشته‌های مختلف نشان داده‌شده است. گاهی هر انگشت علاوه بر اندرکنش با توالی اختصاصی خود، با بازهای مجاور نیز اندرکنش نشان می‌دهد(CوD). این موضوع روند یک طراحی قابل تکرار را مختل می‌کند.

به دلیل اینکه ۱۸ جفت باز می‌تواند اختصاصیتی در بین ۶۸ میلیارد جفت باز را تضمین کند ، این فناوری اجازه می‌دهد توالی‌های خاصی که قرار است در ژنوم برای اولین بار هدف‌گیری شود به‌راحتی مورد شناسایی قرار گیرد. روش ساخت انگشت روی برای یک DNA ویژه یا با طراحی منطقی یا همان طراحی بر اساس میل ترکیبی اسیدهای آمینه با بازهای آلی انجام می‌شود و یا اینکه از یک کتابخانه بزرگ انگشت روی به روش “گزینش ماژول “(انتخاب از میان موتیف های موجود در کتابخانه انگشت روی و برزدن آن‌ها برای رسیدن به‌توالی اسیدآمینه‌ای مدنظر که قادر به شناسایی توالی هدف می‌باشد) موردنظر به دست می‌آید. به‌واسطه این خاصیت انگشت روی، می‌توان توالی‌های بسیار ویژه‌ای از ژنوم را شناسایی نمود. علاوه بر این، پروتئین‌های دیگری که می‌توانند روی DNA تغییر ایجاد کنند را می‌توان به مولکول انگشت روی پیوند داد. در حال حاضر انواعی از این مولکول‌های مهندسی‌شده (ZFPها )تولیدشده‌اند که می‌توانند وظایف ویژه‌ای را انجام دهند. در زیر تعدادی از سازه‌های مهندسی‌شده آمده است:
۱) نوکلئاز انگشت روی (ZF-Nuclease): ایجاد شکاف در ناحیه هدف‌گیری شده و جهش‌زایی
۲) متیلاز انگشت روی (ZF-Methylase): خاموشی ژن با متیلاسیون پروموتر موردنظر
۳) انگشت روی بازدارنده (ZF-Repressor): بازدارندگی یک ژن خاص یا خاموش کردن رونویسی
۴) انگشت روی فعال‌کننده (ZF-Activator): فعال‌سازی یک ژن خاص یا روشن کردن رونویسی.

برای روشن شدن نحوه عمل این مولکول‌های نوترکیب، یک مثال از طراحی ناقل و ارزیابی مولکول نوترکیب انگشت روی و RNA پلی مراز آورده می‌شود(شکل۵). برای سنجیدن دقت اتصال و افزایش بیان یک ژن ابتدا یک پروتئین انگشت روی برای پروموتر اختصاصی آن ژن طراحی می‌شود. بدین ترتیب که با جهش در ژن‌های انگشت روی، پروتئینی به دست می‌آید که با پرموتر ژن حداکثر اتصال را ایجاد می‌کنند سپس این مولکول مهندسی‌شده به کمک یک اتصال‌دهنده به مولکول عملگر که در اینجا RNA پلی مراز است پیوند داده می‌شود. کل این سازه (انگشت روی، اتصال‌دهنده و RNA پلی مراز ) روی یک ناقل، و جایگاه اتصال انگشت روی و پرموتر موردنظر (معمولاً یک پرموتر ضعیف) و ژن گزارشگر پایین‌دست آن روی ناقل دیگر (پلاسمید گزارشگر ) طراحی می‌شوند. با ورود این دو پلاسمید به درون سلول و بررسی الگوی بیان ژن گزارشگر می‌توان کارایی سیستم طراحی‌شده را ارزیابی نمود .

انگشت روی نوترکیب با RNA پلیمراز(RNAP) انگشت روی نوترکیب با RNA پلیمراز(RNAP) که به پروموتر ضعیف(Pwk) بالادست ژن بیان‌کننده پروتئینGFP به‌صورت اختصاصی متصل می‌شود. در قسمتB پلاسمید بیان‌کننده ژن نوترکیب انگشت روی و RNAپلیمراز (سمت راست) و پلاسمید حمل‌کننده توالی محل اتصال انگشت روی، پروموتر ضعیف و ژن GFP (سمت چپ) نشان داده‌شده است. حضور دو پلاسمید در سیستم سلولی سبب افزایش بیان پروتئین GFP ، علیرغم پروموتر ضعیف بالادست آن، می‌شود.

انتظار این است که ZFP های طراحی‌شده برای توالی هدف خود حداکثرمیل ترکیبی را داشته باشند. البته حضور اسیدآمینه آسپارژین در موقعیت ۲+ حاضر در مارپیچ آلفا در انگشت روی کناردستی می‌تواند با بازهای خارج از تریپل کانونی خود تماس داشته و سبب همپوشانی موتیف های ZF شود. این موضوع، علاوه برافزایش میل ترکیبی پروتئین‌های مهندسی‌شده ZFP به‌توالی اختصاصی هدف (اتصال بیش‌ازاندازه)، مانع ایجاد یک ساختار ساده و قابل‌برنامه‌ریزی در طراحی می‌شود. بنابراین از طراحی منطقی ZFها برای اتصال به‌توالی اختصاصی جلوگیری می‌شود. این مسئله (همپوشانی در توالی هدف)، تنها زمانی رخ می‌دهد که اسیدآمینه آسپارژین در موقعیت ۲+ مارپیچ انگشت روی ماقبل وجود داشته باشد. بنابراین، در اکثر نمونه‌ها به دلیل حضور آسپارژین موتیف های انفرادی انگشت روی تمایل دارند تا چهار جفت باز را به‌جای یک تریپل تشخیص دهند که این خود، راهبردهای طراحی را مختل می‌کند. البته نمونه‌های موفقیت‌آمیز مهندسی‌شده برای کاربردهای معمول در زیست‌شناسی سلولی و مولکولی طراحی نیز شده است.

ساختار دامنه اندونوکلئاز آنزیم FokI:
در طبیعت آنزیم برشی FokI با وزن مولکولی ۶۵٫۴ kDa در Flavobacterium okeanokoites یافت می‌شود. این آنزیم یک اندونوکلئاز باکتریایی تیپIIS است که در انتهای آمینو به DNA (یک توالی پنتاداکسی ریبونوکلئوتید غیر پالیندرومی ۵′-GGATG-3′:3′-CATCC-5′) متصل می‌شود. و در ناحیه کربوکسیلی برش غیراختصاصی (۹ تا ۱۳ نوکلئوتید پایین‌تر از محل تشخیص) ایجاد می‌کند(۶-۳). بنابراین محتوای توالی جایگاه برش هر چه باشد توسط آنزیم قطع خواهد شد. در موقع اتصال دامنه متصل شونده به‌توالی مورد تشخیص، پیامی به دامنه اندونوکلئازی منتقل می‌شود و برش رخ می‌دهد.

اندونوکلئاز آنزیم FokI

 آنزیم نوکلئاز FokI در شرایط طبیعی دارای دامنه تشخیصی و دامنه برشی می‌باشد. در ویرایش ژنوم از دامنه برشی آن استفاده می‌شود و دامنه تشخیصی آن با دیگر دامنه‌ها ازجمله ZFها و TALEهای مهندسی‌شده جایگزین می‌شود.

منطقی است که می‌توان دامنه تشخیص این آنزیم را با دامنه تشخیصی دیگر برای ایجاد یک نوکلئاز کایمر معاوضه کرد. خوشبختانه این ایده در عمل درست از آب درآمده و این تغییر شدنی است. این آنزیم برای انجام فعالیت برشی به یون منیزیم نیاز دارد همچنین دیمر شدن ناحیه اندونوکلئازی برای برش ضروری است.

(ZFN ( zinc finger nuclease
ازآنجاکه هر انگشت روی سه جفت باز را شناسایی می‌کند، می‌توان با کنار هم قرار دادن سه انگشت روی ، ۹bp را شناسایی نمود. و اگر دو ZFN را طوری طراحی کنیم که آنزیم برشی به‌صورت سربه‌سر باهم دیگر دیمر شوند آنگاه می‌توان ۱۸bp (که اختصاصیت بسیار بالایی در سطح ژنوم محسوب می‌شود) را تشخیص داد. همان‌طور که قبلاً نیز اشاره شد، به دلیل وجود جایگاه Asp در موقعیت ۲+ انگشت روی، ممکن است هرز شدن در جایگاه تشخیص صورت گیرد. بنابراین علی‌رغم اینکه انتظار می‌رود سه انگشت روی به‌صورت دایمر قادر به تشخیص ۱۸bp در توالی هدف باشند، در عمل بسته به اختصاصیت انگشت‌های طراحی‌شده تشخیص واقعی آن‌ها بینbp 18-12 خواهد بود. درنتیجه برای جبران این کاستی بایستی انگشت روی‌های بیشتری را در طراحی در نظر گرفت.

اثرگرهای شبه فعال‌کننده‌های رونویسیTALEها ( Transcription Activator Like Effectors)

TALEها پروتئین‌هایی هستند که از باکتری Xanthomonas کشف‌شده‌اند و دارای دامنه متصل شونده به DNA متشکل از ۳۵-۳۰ توالی آمینواسیدی هستند. به‌استثنای اسیدآمینه‌های ۱۲ و ۱۳ که خیلی متغیراند (RVDs) و در تشخیص نوکلئوتید نقش دارند، بقیه بنیان‌ها تکراری و فوق‌العاده حفاظت‌شده هستند. اختصاصیت TALEها با دو اسیدآمینه۱۲و۱۳ که بسیار متغییر هستند ایجاد می‌شوند. در TALEهای هر تکرار(۳۴ اسیدآمینه) یک جفت باز را تشخیص می‌دهد. باهم افزایی تکرارهای پروتئین‌های طبیعی TALE شمار بازهای شناسایی‌شده به ۱۷ نوکلئوتید هم می‌رسد. بنابراین برای تشخیص چنین توالی ۵۷۸ اسیدآمینه درگیر خواهند بود. اخیراً کارکرد RVDها به‌صورت محاسباتی و تجربی معلوم شده است. هر RVD یک اتصال تک نوکلئوتیدی از طریق اندرکنش مستقیم باDNA ایجاد می‌کند. چهار RVD مختلف بنام Asn-Asn, Asn-Ile, His-Asp و Asn-Gly به‌طور گسترده به ترتیب برای شناسایی گوانین، آدنین، سیتوزین و تیمین استفاده می‌شوند. بنابراین در شکل‌های مهندسی‌شده تنها از ماژول های ۱۲ و ۱۳ که برای تشخیص DNA کافی هستند استفاده می‌شود و با کنار هم قرار دادن مصنوعی آن‌ها در کنار همدیگر توالی مدنظر شناسایی خواهد شد. این در حالیست که در انگشت روی هر سه اسیدآمینه یک باز را شناسایی می‌کند. این موضوع سبب می‌شود محقق در طراحی پروتئین مطلوب راحت‌تر عمل کند. همچنین برخلاف پروتئین‌های انگشت روی، ساخت آرایه‌ای طولانی از TALEها برای افزایش اختصاصیت نیاز نیست. هرچند به دلیل همانندی زیاد توالی‌های تکراری TALEهمواره در همسانه سازیشان چالش‌هایی وجود داشته است. از طرف دیگر محدودیتی که بیشتر در مقالات در تشخیص DNA هدف توسط TALEها اشاره می‌شود این است که محل اتصال این پروتئین باید با باز تیمین شروع شود. به‌صورت کلی می‌توان مولکول‌های عملکردی که به انگشت روی پیوند داده می‌شوند را در TALEها استفاده کرد. ولی پرکاربردترین پروتئین نوکلئاز می‌باشد که سبب تولید TALEN می‌شود. لازم به ذکر است که معمولاً برای افزایش کارایی جایگاه برش و اختصاصیت، مولکول مهندسی‌شده به‌صورت دوقلو طراحی می‌شوند.

تکرارهای TALE (توالی‌های RVD که در تشخیص اختصاصی DNA نقش اساسی دارند. بقیه اسیدهای آمینه که دو تکرار را به هم متصل می‌کنند و حفاظت‌شده هستند، در شکل نیامده‌اند ) به‌صورت حلقه نشان داده‌شده‌اند. حروف داخل هر حلقه (تکرار)، نشان‌دهنده دو بنیان آمینواسیدی بسیار متغیر می‌باشد. دامنه‌های C و Nکه برای اتصال به DNA موردنیاز هستند به‌صورت حلقه‌های بزرگ‌تری نشان داده‌شده‌اند. دامنه نوکلئازی غیراختصاصی از FokI به رنگ نارنجی به انتهای TALEمتصل شده است.
ب: TALEN به حالت دیمر روی DNA هدف قرار می‌گیرند و آن را برش می‌دهند. برش FokI در توالی فاصله‌انداز (spacer ) که بین دو مونومر TALEN قرارگرفته انجام می‌شود.
ج: شمای یک دامنه TALE: توالی اسیدآمینه‌ای یکی از تکرارهای TALE به همراه اسیدهای آمینه ۱۲ و ۱۳ در زیر آن به ترتیب نشان داده‌شده است.
د: توالی آمینواسیدی TALEو توالی DNA متناظر که قرار است به آن متصل شود، زیرهمچینی شده‌اند. نکته اینکه جور شدن دامنه‌های تکراری با بازها در توالی هدف با انطباق پروتئین TALE انجام می‌شود و دیگر اینکه حضور تیمین در ناحیه ۵ قبل از شروع اتصال با TALEضروری است.

نقش اثرگرهای TAL در طبیعت
درمجموع گونه‌های مختلفXanthomonas ، Ralstonia و Salanacearum طیف وسیعی از محصولات زراعی و گیاهان زینتی را موردحمله قرار می‌دهند. ژنوم های توالی یابی شده xanthomonas معمولاً بین صفر تا شش اثرگر TAL را رمز می‌کنند. حال‌آنکه در برخی تا ۳۰ ژن TALEهم رمز می‌شود.
اثرگرهای شبه فعال‌کننده‌های رونویسی( TALEها) که توسط باکتری‌های جنس xanthomonas به سلول گیاهی تزریق می‌شوند ،در هسته سلول میزبان به‌عنوان فاکتورهای بیماری‌زایی عمل می‌کنند. بدین ترتیب آن‌ها ژن‌های لازم برای ایجاد حساسیت (ژن‌های S ) و یا در موارد کمتر به‌عنوان فاکتورهای غیر بیماری‌زا برای فعال‌سازی یک ژن که مقاومت را القا می‌کند، عمل می‌کنند (ژن‌های R ).

پروتئین TALE های طبیعی در ناحیه تشخیص DNA خود دارای یک توالی تکراری اسیدآمینه‌ای تکراری هستند و میانگین تکرار در این ناحیه ۱۶٫۵ دفعه است. علیرغم تنوع طبیعی که در تکرارهای TALEوجود دارد، آزمایشات تجربی نشان می‌دهند حداقل ۱۰ تکرار برای انجام فعالیت TALEموردنیاز است. بنابراین اثرگرهای TAL با کمتر از ۱۰ تکرار احتمالاً یا به‌عنوان بقایای ژن‌های گذشته‌اند و یا می‌توانند از طریق نوترکیبی ژن‌های جدیدی از TALEرا برای سازگاری ایجاد کنند. TALE از طریق سیگنال‌هایی که در انتهای کربوکسیلی خود دارد وارد هسته می‌شود سپس ناحیه تکراری TALEبه‌توالی موردنظر از ژنوم متصل می‌شود . وقتی TALE به پروموتر یک ژن متصل می‌شود رونویسی از آن ژن فعال می‌شود. اینکار از طریق فعال شدن اسیدی انتهای C پروتئین انجام می‌شود.

مولکول TALE طبیعییک مولکول TALE طبیعی. در ناحیه Nانتهایی توالی موردنیاز به جابجایی از سلول باکتری به سلول گیاهی وجود دارد. در ناحیه توالی تکرارشونده، اسیدآمینه‌های تشخیص‌دهنده DNA وجود دارند. همان‌طور که در شکل ملاحظه می‌شود تعداد تکرار در این ناحیه بسته به گونه باکتری از ۱٫۵ تا ۳۳٫۵ تکرار متغیر است. در قسمت Cانتهایی توالی مخصوص قرارگیری در هسته سلول گیاهی و دامنه فعال‌کننده رونویسی مشاهده می‌شود. b- توالی اسیدآمینه‌ای ماژول های ۱۲ و ۱۳ از پروتئین AvrBs3 (یک TALE بسیار مهاجم به سلول‌های گیاهی) و جعبه UPA از DNA ژنومی گیاهی که توسط آن تشخیص داده می‌شود.

اکثر TALEها ژن‌های حساسیت را فعال می‌کنند که بیان این ژن‌ها سبب تکثیر و گسترش باکتری و بروز علائم بیماری می‌شود. بعضی از TALEها ژن‌های فاکتورهای رونویسی و ژن‌های تنظیمی را موردحمله قرار می‌دهند که به‌موجب آن تقسیم سلولی و اندازه آن دچار تغییر می‌شود. گیاهان سازوکارهای مقاومتی برای خنثی نمودن TALEها بکار می‌گیرند. این مقاومت‌ها شامل سازگاری‌هایی است که از فعال شدن ژن‌های حساسیت جلوگیری می‌کنند. درواقع با حذف یا درج نمودن چند نوکلئوتید در پروموتر این ژن‌ها مقاومت در گیاه حاصل می‌شود. با این کار TALEها روی پروموتر قرار نمی‌گیرند و درنتیجه، تحریک رونویسی ژن‌های حساسیت انجام نمی‌شود. روش دیگر ایجاد مقاومت، شبیه‌سازی پروموترهای ژن‌های مقاومت با ژن‌های حساسیت است. فعال شدن ژن‌های مقاومت موجب مرگ موضعی سلول‌ها شده و از گسترش بیماری جلوگیری می‌کند. بنابراین TALEها در گیاه مقاوم بجای فعال کردن ژن‌های حساسیت، ژن‌های مقاومت را فعال می‌کنند. نتیجه اینکه با کشف نحوه ارتباط TALEها با DNA میزبان، درک ما از مکانیسم‌های مقاومت و بیماری و نیز توانایی ما در تشخیص منابع جدید مقاومت افزایش یافته است. به‌عنوان‌مثال شناخت ژن‌های حساسیت (S) به بهنژادگر اجازه می‌دهد آلل هایی را انتخاب کند که فاقد محل اتصال برای TALEها باشد. همچنین با اسکن کردن تمامی پروموترهای موجود در ژنوم گیاهی و بررسی جور شدن آن با TALEها می‌توان کاندیداهای جدیدی از ژن‌های حساسیت که در بیماری زایی نقش دارند را شناسایی و در ادامه، هرکدام از این کاندیداها را برای میزان تاثیری که روی حساسیت دارد موردبررسی قرارداد. چنین راهبردی را نیز می‌توان برای گیاه مقاوم در پیش گرفت و ژن‌های مقاومت جدید را شناسایی‌نمود.

 اثرگرهای TALE ایجاد بیماری توسط باکتری زانتوموناس و استراتژی مقاومت مهندسی‌شده در برابر آن‌ها با ویرایش جایگاه تشخیصی اثرگرهای TALE

اثر گرهای TAL ، طراحی ، ساخت و ملاحظات
برای اعمال تغییر در ژنوم، مولکول TALE به‌راحتی قابل طراحی است. چندین وب‌سایت برخط محقق را در طراحی کمک می‌کنند. از این میان می‌توان به ZiFiT , Mojohand و TALNT اشاره کرد. برای ساخت پروتئین طراحی‌شده معمولاً از روش سرهم‌بندی ماژول‌ها (کنار هم قرار دادن RVDها به ترتیبی که خواست محقق است) استفاده می‌شود. همچنین، شرکت‌های مختلف مواد و کیت‌های لازم را تولید و عرضه می‌کنند. به دلیل راحتی در کاربرد اثرگرهای TAL آن‌ها به‌طور گسترده در زیست‌شناسی سامانه‌ها (systen biology) ، مهندسی ژنتیک ، انجام تحقیقات بنیادی پزشکی و اصلاح محصولات زراعی و دامی مورداستفاده قرارگرفته است.
از مزایای اثرگرهای TAL (همانند انگشت روی) ، امکان تولید پروتئین کایمر است. علاوه بر آنزیم نوکلئاز می‌توان آنزیم ریکامبینازها به TALE اضافه کرد. ریکامبینازها سبب نوترکیبی بین محل‌های تشخیص می‌شوند و طیفی از تغییرات ژنومی همچون حذف و اضافه کردن قطعات بزرگ و وارونگی را ایجاد می‌کنند.

 کاربردهای متنوع سیستم TNALE.

باوجوداینکه اثرگرهای TAL طراحی‌شده ابزار قدرتمندی در زیست‌شناسی سلولی و مولکولی به‌حساب می‌آیند، اما چالش‌ها و سوالاتی در کاربرد آن‌ها باقی می‌ماند. باید در نظر داشت که سازه‌های طراحی‌شده TALEبا درجه‌های مختلفی از کارایی عمل می‌کنند. همان‌طور که قبلاً نیز اشاره شد، باوجود ماژول بودن اسیدآمینه‌ها میل ترکیبی نوکلئوتید ترجیحی برای RVDها متفاوت است. بنابراین میزان کارایی به ترکیب RVDها و توالی هدف برمی‌گردد. بنابراین باید RVDهایی را گزینش کرد که بالاترین میل ترکیبی رادارند. علاوه بر میل ترکیبی، اختصاصیت نیز اهمیت زیادی دارد. با زیرهمچینی تقریباً تمام TALهای شناخته‌شده با توالی‌های مورد شناسایی آن‌ها به این نتیجه می‌رسیم که همه RVDها به نوکلئوتید موردعلاقه خود متصل نمی‌شوند و در اکثر مواقع یک یا چند RVD فاقد اختصاصیت است. بنابراین TALهایی که در ظاهر به‌صورت اختصاصی طراحی‌شده‌اند پتانسیل اثر روی توالی‌های غیر هدف رادارند. همچنین، تأثیر محتوای واقعی محل اتصال و وضعیت کروماتین که نقش مهمی در انجام واکنش دارند هنوز به‌طورجدی بررسی نشده‌اند. از طرف دیگر به دلیل اندازه بزرگ و وجود ساختارهای تکراری در پروتئین‌های TAL یا سازه‌های بیانی ممکن است مشکلاتی در انتقال آن‌ها ایجاد کند. این موضوع به نوع سلول و یا روش انتقال بستگی دارد. مثلاً برای انتقال TALEتوسط سازه‌های ویروسی به سلول پستان داران اندازه محدودکننده است و تکرارها یاRVDs سازه‌های ناپایدار ایجاد می‌کنند.

سیستم CRISPR-Cas :
این سیستم در شرایط طبیعی سبب ایمنی اکتسابی در باکتری‌ها و آرکئی ها در مقابل باکتریوفاژها و پلاسمیدها می‌شود . درواقع ژنوم باکتری‌ها حاوی مکآن‌هایی از توالی‌های تکراری چندگانه و کوتاهی هستند که در تشخیص و تخریب ژنوم ویروس مهاجم، باکتری را کمک می‌کنند(شکل۱۱-۳). به‌این‌ترتیب که بعد از تزریق DNA فاژ به محیط سیتوپلاسمی‌ سلول (مرحله دریافت )، جایگاه ژنومی CRISPR که در بردارنده قطعات مکمل با ژنوم فاژهای مختلف است قسمتی از DNA فاژ مهاجم را توسط RNA راهنما ، که از جایگاه CRISPR به‌صورت پیش RNA رونویسی می‌شود (مرحله بیان) ، شناسایی کرده و با توالی هدف در فاژ، مکمل می‌شود. پس از بیان پروتئین /آنزیم‌های مرتبط با جایگاه CRISPR که فعالیت اندونوکلئازی دارند DNA ویروس را تخریب می‌کنند (مرحله بازدارندگی) .

نحوه مبارزه با فاژ مهاجم توسط سیستم CRISPRنحوه مبارزه با فاژ مهاجم توسط سیستم CRISPR. در باکتری مقاوم به یک فاژ خاص، قطعه‌ای از DNA فاژی به‌صورت خاطره در جایگاه CRISPRژنوم درج‌شده است. پس از دریافت DNA فاژی (مرحله اول) ،از روی جایگاه CRISPR برای ساخت RNA راهنما رونویسی شده و پروتئین‌ها و آنزیم‌های نوکلئاز مرتبط با آن(Cas proteins) بیان می‌شوند (مرحله دوم). با هدایت RNA راهنما قسمت (های) ویژه‌ای از ژنوم فاژ توسط آنزیم‌های برشی تخریب می‌شوند (مرحله سوم).

مولکول crRNA یا RNA راهنما با کمک مولکول فعال‌کننده (trans activating crRNA) RNA که تقریباً در طبیعت حفاظت‌شده است، یک RNA با ساختار دوم تشکیل می‌دهند که اندونوکلئاز را برای برش DNA هدف هدایت می‌کند. همچنین، تحقیقات نشان داده است وجود موتیف مجاور RNA راهنما موسوم به PAM در رشته غیرمکمل DNA هدف ضروری می‌باشد.

crisper/cas9

استفاده از این سیستم برای ویرایش ژنوم به طراحی آزمایشگاهی و مهندسی سیستم CRISPR/Cas9 توسط خانم‌ها جنیفر دودنا و امانوئل شرپنتایر در سال ۲۰۱۳ برمی‌گردد. در سال ۲۰۱۵ این سیستم توسط مجله علمی Science به‌عنوان بزرگ‌ترین کشف سال شناخته شد.

تقسیم‌بندی سیستم‌های طبیعی CRISPR-Cas
در سال ۲۰۱۱ ماراکووا و همکاران سامانه‌های کشف‌شده CRISPR-Cas را بر اساس پروتئین Cas به سه نوع I ، II و III تقسیم‌بندی کردند. در هر سه گروه، پروتئین‌های Cas1 و Cas2 حضور دارند. البته کمپلکس اثرگر که باعث فعالیت برشی می‌شود در میان CRISPR-Casهای مختلف باهمدیگر متفاوت است.

در سیستم نوع I که در باکتری‌ها و آرکئی ها یافت می‌شود، آنزیم Cas3 فعالیت اندونوکلئازی را روی توالی DNA انجام می‌دهد. در سیستم نوع II که تنها در باکتری‌ها گزارش‌شده است علاوه بر Cas1 و Cas2 ، پروتئین Cas9 نیز حضور دارد و برش توالی را انجام می‌دهد. این پروتئین دارای کارکرد چندگانه است و علاوه بر القا برش توالی هدف در ژنوم فاژی، توانایی تبدیل pre-crRNA به crRNA را دارد. علاوه براین حضور tracrRNA و موتیف های PAM ، از ویژگی‌های سیستم نوعII می‌باشد. سیستم نوع II به دلیل سادگی در برنامه‌های ویرایش ژنوم بسیار پرکاربرد است. در سیستم نوع III پروتئین‌های Cas10 و Cas6 بعلاوه RAMPها حضور دارند. Cas10 در برش DNA و پردازش crRNA نقش دارد. پروتئین‌های Cas6 و RAMPها نیز در پردازش crRNA درگیر هستند. این سیستم بیشتر در آرکئی ها رایج است.

انواع سیستم‌های مختلف CRISPR-Cas

کاربردهای سیستم CRISPR-Cas9
در حال حاضر بر اساس این سیستم ویرایش ژنوم موجودات مختلف در شرایط آزمایشگاهی صورت گرفته است. درواقع با بهینه و مهندسی نمودن این سیستم توسط محققان، امکان تغییرات گسترده‌ای در ژنوم موجودات فراهم‌شده است. این سیستم در موجودات مختلف و برای اهداف متنوع ازجمله ایجاد جهش نقطه‌ای مشابه آنچه در چندشکلی تک نوکلئوتیدی طبیعی رخ می‌دهد، تغییر دقیق عمل ژن، تلفیق چند ژن خارجی برای هرم بندی ژن‌ها، متوقف کردن ژن، انتقال پروتئین‌های گوناگون به قسمت‌های مدنظر در سطح ژنوم، فعال‌سازی یا بازداندگی از بیان ژن و ویرایش اپی ژنوم را می‌توان برشمرد. درنهایت، توسعه این فناوری برای مطالعه نقش DNA غیر رمز گردان در تنظیم و بیان ژنها نیز مورد توجه می‌باشد چراکه با این رویکرد مکان‌های تنطیمی ناشناخته برای ژن موردنظر ممکن است پیدا شود. در زیر به چند مثال از کاربردهای این سیستم اشاره می‌شود.

کنترل هپاتیت B و HIV
اغلب درمان‌های حال حاضر برای بیماری هپاتیت B مزمن شامل استفاده از اینترفرون ها یا آنالوگ‌های نوکلئوتیدی/نوکلئوزیدی به شکست منجر می‌شود و با متوقف نمودن درمان، بیماری دوباره شروع می‌شود. امروزه روشن‌شده است که داروهای NA (بازدارنده‌های فعالیت رونوشت بردار معکوس) به‌خوبی از همانندسازی HBV جلوگیری می‌کنند اما هیچ اثری روی حذف الگوهای همانندسازی ویروس هپاتیت B یا همان (DNA حلقوی بسته‌شده کووالانت (cccDNA ندارند. علاوه براین، cccDNA این ویروس از خود ثبات زیادی نشان می‌دهد و در شرایط تحت درمان، تعداد نسخه‌های آن به‌کندی کاهش پیدا می‌کند درنتیجه آن‌ها موانع بزرگی برای درمان محسوب می‌شوند. بنابراین محققان در کنار استفاده از داروهای NA برای جلوگیری از همانندسازی HBV از روش ویرایش ژنوم برای حذف cccDNA استفاده کرده‌اند. به‌نحوی‌که با طراحی و بیان یک gRNA یا gRNA های اختصاصی برای HBV و آنزیم نوکلئاز Cas9 از تولید پروتئین‌های HBV در شرایط In Vitro جلوگیری به عمل آمد.

در کنترل ویروس نقص ایمنی اکتسابی انسان( HIV ) نیز چنین مشکلاتی وجود دارد. علیرغم اینکه درمان‌های ضد رتروویروسی قادر به کنترل همانندسازی HIV است، ژنوم آن به‌صورت مخفی در درون ژنوم میزبان درج می‌شود. در این حالت ژنوم ازنظر رونویسی غیرفعال می‌شود و بعد از درمان هرلحظه احتمال دارد ژنوم مخفی‌شده دوباره تکثیر ویروس را آغاز کند و بدین ترتیب مشکل اصلی در کنترل و درمان را ایجاد می‌کند. در گزارشی که در سال ۲۰۱۳ به چاپ رسید دانشمندان ژاپنی اعلام کردند که به کمک فناوری CRISPR توانسته‌اند ژنوم درج‌شده HIV را از میزبان خارج سازند. آن‌ها با طراحی gRNA برعلیه پروموتر LTR که در دو انتهای ژنوم ویروس است و نقش مهمی در بیان ژن‌های HIV دارد، توانستند بدون اینکه به محل دیگری از ژنوم میزبان آسیب وارد شود، به‌صورت اختصاصی حذف ژنوم ویروس انجام شود. درواقع پس از توالی یابی کل ژنوم میزبان پس از تیمار با gRNA و آنزیم Cas9 معلوم گردید که هیچ‌گونه توالی غیر هدفی در ژنوم تخریب نشده است.

مقایسه سه روش پرکاربرد در ویرایش ژنوم

مقایسه سه روش پرکاربرد در ویرایش ژنوم

ویرایش RNA از طریق سیستم CRISPR-Cas9

در ویرایش ژنوم توسط TALEو ZFP ها تنها سوبسترای قابل‌شناسایی DNA می‌باشد. اما به‌واسطه سیستم CRISPR/Cas می‌توان برنامه‌هایی برای ایجاد تغییر در RNA نیز ایجاد نمود. در جدول زیر مقایسه‌ی این سه روش ازنظر طول توالی تشخیصی، قابلیت راه‌اندازی در آزمایشگاه، اثر روی توالی غیر هدف و نوع سوبسترا آورده شده است.
همان‌طور که قبلاً اشاره شد، در سیستم CRISPR-Cas9 توالی‌های PAM برای تشخیص DNA هدف که معمولاً در شرایط طبیعی پاتوژن‌ها می‌باشند، ضروری هستند. یکی از وظایف احتمالی PAMها ایجاد تفاوت بین توالی‌های بالقوه مشابه در میزبان و توالی‌های هدف در پاتوژن مهاجم می‌باشد. این سیستم از برش توالی DNA که در محتوای آن PAM موجود نباشد صرف‌نظر می‌کند. از طرف دیگر مولکول‌های PAM در شکل‌گیری کمپلکس Cas9-gRNA روی توالی هدف نقش اساسی دارند.
آنزیم Cas9 از باکتری Streptococcus pyogenes توالی ۳ NGG- 5 روی توالی غیر الگو را به‌عنوان نشانه تشخیص می‌دهد. علاوه بر این، دامنه نوکلئازی این آنزیم قابلیت برش RNA را دارد. بر اساس این داده‌ها می‌توان برای برش DNA تک‌رشته‌ای و RNA تک‌رشته‌ای و RNAدو رشته‌ای PAMهای مصنوعی طراحی کرد. سیستم CRISPR-Cas9 در بهترین حالت DNA دو رشته‌ای را به کمک gRNA (یعنی دورگ dsDNA+ssRNA) برش می‌دهد. بنابراین، برای نزدیک شدن به چنین شرایطی بایستی برای برش ssRNA به PAM های مصنوعی از جنس داکسی ریبونوکلئوتید نیاز است.

فناوری CRISPR/Cas قادر است بر روی RNA ، انواع ویرایش را انجام دهد.

CRISPR-Interference
سیستم CRISPR علاوه بر کاربرد در ویرایش ژنوم در تنظیم بیان ژن نیز مورداستفاده قرار می‌گیرد. اخیراً CRISPR مداخله‌گر برای خاموشی ژن معرفی‌شده است. درواقع رویکردی مکمل برای RNA مداخله‌گر فراهم می‌کند. بیان هم‌زمان dCas9 (آنزیم ناقص Cas9 که ازنظر عملکردی قادر به برش نیست) با gRNA ساخته‌شده برای ژن مدنظر، سبب اتصال کمپلکس dCas9-gRNA به رشته DNA غیر الگو شده و فرایند ادامه رونویسی را بلوکه می‌کند. این رویکرد برای جلوگیری از اندرکنش میان موتیف های DNAسیس و فاکتورهای رونویسی متصل شونده به آن‌ها در منطقه پروموتر مورداستفاده قرارگرفته است. با این کار آغاز رونویسی بلوکه می‌شود. ناک داون کردن ژن (کاهش بیان ژن) توسط CRISPRi بسیار اختصاصی بوده و در عمل برگشت‌پذیر است. مزیت دیگر CRISPRi به RNAi این است که به‌طور هم‌زمان می‌توان توالی‌های چندگانه را برای خاموشی مورد هدف قرارداد. CRISPRi پتانسیل بسیار بالایی برای به‌کارگیری در پروژه‌های خاموشی ژن دارد.

اثر سیستم –Cas9 CRISPR روی توالی‌های غیر هدف و به حداقل رساندن آن
برای بهبود کارایی و اختصاصیت Cas9 CRISPR-، تجزیه‌وتحلیل توالی‌های غیر هدف احتمالی ضروری است. در مطالعه بر روی سلول‌های انسانی معلوم گردیده این سیستم با فراوانی نسبتاً بالایی روی توالی‌های غیر هدف اثر می‌گذارد. اما این اثر روی سلول‌های موش ، ماهی گوراسبی، آرابیدوپسیس و توتون کم بوده است. البته از طریق PCR و توالی یابی کل ژنوم در گیاهان، برش توالی‌های غیر هدف گزارش‌شده است. اثر بر روی توالی‌های غیر هدف یک نگرانی بالقوه است. برای پاسخ به اینکه چرا آنزیم طبیعی Cas9 توالی غیر هدف را برش می‌دهد، ساختار آن با دقت بسیار بالا در ترکیب با gRNA و توالی DNA موردبررسی قرارگرفته است. این یافته‌ها میزان تحمل جور شدن ناجور gRNA و توالی DNA هدف را بیان می‌کند. معلوم گردیده برای فائق آمدن بر مشکل اثر روی توالی غیر هدف، آنزیم جهش‌یافته Cas9-nickase برای ایجاد برش در یک‌رشته از DNA هدف به‌خوبی عمل می‌کند. این تغییر، سبب فعال شدن نوترکیبی همتا در آن محل و تشخیص اختصاصی هدف می‌شود. روش دیگر استفاده از Cas9-nickase در ترکیب با یک جفت gRNA جهت ایجاد nick در دو رشته می‌باشد. این عمل به‌راحتی می‌تواند حمله به‌توالی های غیر هدف را کاهش دهد. از طرف دیگر غلظت بالای Cas9 و gRNA سبب افزایش برش توالی‌های غیر هدف و کاهش غلظت آن‌ها تخریب توالی‌های غیر هدف را کاهش می‌دهد.

print
Tags: , , , , , ,


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

پانزده − 6 =