تکثیر دئوکسی ریبونوکلئیک اسید (PCR)

تکثیر DNA

تکثیر هدفمند قطعه‌ای از ژنوم در انجام آزمایش‌های زیست‌شناسی از اهمیت بسزایی برخوردار است. به‌عنوان نمونه برای مطالعه ژن‌ها و به دست آوردن نمونه‌ای خالص از یک ژن به‌طور کامل یا قطعه‌ای خاص از آن، به تکثیر آن قطعه نیازمندیم تا بتوانیم مطالعات بعدی خود را بر روی آن انجام دهیم. مثلاً اگر قرار باشد این ژن را به پروتئین تبدیل یا به موجود دیگری منتقل و اثر آن را بررسی کنیم یا زمانی که هدف شناسایی چندشکلی‌های خاصی در این ژن باشد، و همچنین انواع تحقیق‌های متنوع دیگر تکثیر DNA ضرورت می‌یابد. همچنین در مطالعه‌های بالینی پزشکی در تشخیص بیماری‌های عفونی و صفات و ناهنجاری‌های ژنتیکی تکثیر اسید نوکلئیک حائز اهمیت می‌باشد. روش‌های متعددی برای تکثیر DNA وجود دارد که می‌توان آن‌ها را به سه دسته تکنیک‌های همسانه سازی ژن، روش‌های مبتنی بر PCR و تکنیک‌های هم‌دما تقسیم‌بندی نمود که در ادامه  به آن‌ها اشاره خواهد شد.
همسانه سازی ژن (Gene Cloning)
برای انجام همسانه سازی ژن انجام مراحل زیر نیاز است. در شکل۱ این مراحل به تصویر کشیده شده است. در ابتدا قطعه DNA را که قرار است تکثیر شود بایستی در داخل مولکول DNA حلقوی به نام ناقل درج شود. سپس ناقل به درون سلول میزبان که معمولاً باکتری می‌باشد وارد می‌شود. در مرحله بعد همراه با تکثیر ناقل در سلول میزبان قطعه DNA موردنظر نیز تکثیر می‌شود و هم‌زمان با تقسیم شدن سلول میزبان، ناقل حاوی قطعه موردنظر نیز به سلول‌های دختری واردشده و تکثیر بیشتر رخ می‌دهد. درنهایت پس از تقسیم‌های متعدد تعداد زیادی سلول تولید می‌شود که در هرکدام از آن‌ها یک یا چند نسخه از قطعه DNA موردنظر وجود دارد. در این زمان تکثیر ژن موردنظر صورت گرفته است. این روش برای تکثیر مناسب بوده و توانایی تکثیر قطعه‌های بزرگی از DNA را دارا می‌باشد. اما روش همسانه سازی بسیار وقت‌گیر و سخت بوده و برای انجام آن مهارت‌های زیادی موردنیاز می‌باشد.

مراحل پایه در همسانه سازی ژنواکنش زنجیره‌ای پلیمراز
واکنش زنجیره‌ای پلی مراز یا PCR تکنیکی علمی در زیست‌شناسی مولکولی است که انقلابی در دانش و فناوری‌های زیست مولکولی ایجاد کرد. این تکنیک در سال ۱۹۸۴ توسط کری مولیس بیوشیمیست آمریکایی ابداع گردید و در سال ۱۹۹۳ ، ایشان جایزه نوبل شیمی را به خاطر ابداعش دریافت کردند.
PCR تکنیکی برای تکثیر یک یا تعداد اندکی از نسخههای یک قطعه DNA به میلیونها نسخه است. اساس PCR استفاده از توانایی آنزیم DNA پلیمراز برای سنتز رشتههای جدید DNA است که این رشته‌‌ها همانند DNA رشته الگو هستند. PCR، در حال حاضر روش معمول و در اغلب موارد ضروری در آزمایشگاههای پژوهشی پزشکی و زیستی است و برای انواع برنامه‌های کاربردی ازجمله همسانه سازی ، تعیین توالی DNA ، درخت ژنتیکی یا علم بررسی تکامل موجودات، تحلیل عملکرد ژن‌ها، تشخیص بیماری‌های ژنتیکی، تعیین اثرانگشت DNA (که در علوم پزشکی قانونی و تست رد ابوت استفاده می‌شود) ، و تشخیص آلودگی‌ها و عفونت‌های ویروسی مورداستفاده می‌باشد.
امروزه انواع مختلف PCR توسط شرکت‌ها و محققان ارائه‌شده است این تکنیکها از طریق ایجاد تغییرات مختصری در تکنیک PCR اولیه برای مثال ایجاد تغییرات در نحوه به‌کارگیری پرایمرها و… ایجاد و ابداع‌شده و جهت اهداف خاصی برنامه‌ریزی و اختصاصی شده‌اند.

مراحل واکنش زنجیره‌ای پلی مراز یا PCR

۱٫مرحله واسرشته سازی:

این مرحله اولین مرحله معمول PCR بوده و شامل گرم کردن محیط به میزان ۹۸-۹۴ درجه به مدت ۳۰-۲۰ ثانیه است. این عمل باعث ذوب شدن DNA (جدا شدن دو رشته DNA از همدیگر) هم DNA الگو و هم پرایمر از طریق از بین رفتن پیوندهای هیدروژنی بین نوکلئوتیدهای دو رشته DNA و تولید DNAتک‌رشته‌ای می‌شود.
۲٫مرحله اتصال :

در این مرحله دمای واکنش به ۶۵-۵۰ درجه به مدت ۴۰-۲۰ ثانیه کاهش می‌یابد تا امکان اتصال DNA پلیمراز و پرایمر به DNAالگو که به‌صورت تک‌رشته‌ای است، فراهم شود.
۳٫مرحله گسترش یا طویل شدن :

درجه حرارت این مرحله به آنزیم پلیمراز مورداستفاده و درجه حرارت بهینه موردنیاز برای آن بستگی دارد. به‌طور مثال آنزیم Taqپلیمراز در درجه حرارت ۸۰-۷۵ درجه سانتی‌گراد فعالیت قابل‌قبول دارد. در این مرحله پلیمراز نوکلئوتیدهای مکمل را بر اساس رشته الگو از ۵’به۳’ در کنار هم قرار داده و درنهایت رشته مکمل رشته الگوی اولیه را تولید می‌کند. مدت‌زمان این مرحله به پلیمراز و طول رشته DNA الگو بستگی دارد.

 

انواع تکنیک‌های PCR

PCR گرم آغاز (Hot-Start PCR)
زمانی که بهترین شرایط اتصال فراهم شود اتصالات غیراختصاصی ممكن است قبل از انجام اولین چرخه PCR ایجاد شوند. حتی، تا وقتی‌که دمای لوله‌ها تا °۶۵ افزایش می‌یابد اتصالات غیراختصاصی پرایمر/پرایمر و پرایمر/ الگوممكن است به‌ وجود آید و به‌عنوان پیش ماده اولیه برای DNAپلیمراز عمل كنند. ساده‌ترین روش برای جلوگیری از چنین اتصالات اولیه غیراختصاصی و بهتر کردن شرایط اتصال صحیح پرایمر، استفاده از روش PCR گرم آغاز است. اساس این روش بر جدا كردن فیزیكی مواد واكنش تا زمان رسیدن به دمای تکثیر می‌باشد. یك یا چند ماده قبل از رسیدن به دمای بالاتر از °۷۰ از واكنش خارج می‌شود و پس از رسیدن به دمای بالا در واكنش وارد می‌گردد. به‌صرفه‌ترین راه، اضافه كردن تمامی مواد واكنش به‌جز DNA پلیمراز است.

اما این روش برای تعداد زیاد نمونه‌ها به دلایل زیرامكان پذیر نیست:
الف- زمان موردنیاز برای اضافه كردن آنزیم به هر لوله زیاد است.
ب- اشتباه های ناشی از عدم تمركز حواس كه باعث اضافه نكردن آنزیم به یك یا چند لوله می‌شود .
ج – احتمال آلودگی لوله‌ها به دلیل باز شدن در آن‌ها.

برای حل این مشكل و تسهیل انجام PCR گرم آغاز گروهی از محصولات تجاری عرضه‌شده است که عملکرد برخی به‌اختصار ذکر می‌شود.
۱) دریکی از این روش‌ها ، از آنزیم DNA پلیمراز بهره می‌برد که آنتی‌بادی متصل به آن از فعالیت پلی‌مرازی آنزیم در دمای اتاق جلوگیری به عمل می‌آورد. زمانی که دمای واکنش افزایش می‌یابد آنزیم فعالیت خود را بازمی‌یابد.
۲) گلوله‌های مومی mpliwax Gems را در لوله‌های حاوی پرایمر،dNTPs (دئوكسی نوكلئوتید تری فسفات)، اضافه كرده و واكنش در یك ترموسایكلر در دمای °۷۵ به مدت ۱۰-۵ دقیقه انجام می‌شود تا موم ذوب شود سپس لوله‌ها تا زیر°C35 سرد می‌شوند تا موم مجدداً جامد شود و یک‌لایه محافظ بر روی مواد اولیه واكنش تشكیل شود. مواد دیگر واكنش از قبیل DNAالگو،DNAپلیمراز و بافر را می‌توان بر روی لایه موم ریخت و سپس PCR را آغاز كرد. در هنگام بالا رفتن دما موم ذوب‌شده و مواد جامد موجود در لایه رویی موم با مواد پایین مخلوط می‌شوند تا PCRآغاز شود و موم به روی فاز آبی قرار می‌گیرد. لایه موم هم یك سد در برابر تبخیر آب در حین چرخه‌های دمایی است وهم به‌صورت یك مانع فیزیكی، برای جلوگیری از آلودگی عمل می‌كند.

نحوه عمل PCR گرم آغاز باواسطه آنتی‌بادی

تکثیر تفرقی جهش یا ARMS PCR
این روش تحت عنوان تكثیر اختصاصی آلل‌ها با PCR نیز نامیده می‌شود. این روش برای تشخیص جهش‌های نقطه‌ای به كار می‌رود و جهت تشخیص آلل‌های طبیعی و جهش‌یافته طراحی‌شده است.
این روش بر پایه تفاوت نوكلئوتید انتهای ´۳ پرایمرهایی است كه برای آلل‌های مختلف طراحی‌شده است. دو واكنش PCR با استفاده از یك DNA الگو در۲ لوله جداگانه انجام می‌شود كه یكی از آن‌ها حاوی پرایمرهای جهش‌یافته و دیگری حاوی پرایمر طبیعی می‌باشد( شکل ۴). در هر واكنش، پرایمر مشترك به همراه یكی از ۲ پرایمراختصاصی آلل مورداستفاده قرارمی‌گیرد. حالت اختصاصی پرایمرها برای هریك از آللها ناشی از نوكلئوتید انتهای ´۳ آن‌هاست كه باهم متفاوت می‌باشند. چنانچه پلیمریزاسیون در لوله حاوی پرایمر طبیعی انجام شود، نشان از نبود جهش نقطه‌ای در باز موردنظراست و اگر پلیمریزاسیون در لوله حاوی پرایمر جهش‌یافته انجام شود نشان‌دهنده حضور جهش نقطه‌ای در باز موردنظر است. نكته مهم این است كه بایستی از DNAپلیمرازی كه فاقد خاصیت تصحیح‌كنندگی اگزونوكلئازی ۳ به ´۵ است، استفاده شود زیرا استفاده از یك آنزیم اصلاح‌کننده باعث برداشتن باز جفت نشده انتهای ´۳ می‌گردد و درواقع توانایی متمایز كردن دو آلل از بین می‌رود. از این روش در تشخیص جهش‌های مولد مقاومت دارویی در باکتری‌ها استفاده می‌شود.

در این روش دو واكنش PCR با استفاده از یك DNA الگودر2 لوله جداگانه انجام می‌شود كه یكی از آن‌ها حاوی پرایمرهای جهش‌یافته و دیگری حاوی پرایمر طبیعی می‌باشد.

PCR نامتقارن (Asymmetric PCR)
هدف از به‌کارگیری این روش تولید DNA تک‌رشته‌ای است، که در توالی یابی ژنوم و همچنین تولید پروب کاربرد فراوانی دارد.
در این روش یكی از پرایمرها به تعداد كمتر و پرایمر دیگر به تعداد بیشتر به محیط واكنش اضافه می‌شود تا جائیكه این نسبت ۱:۵۰ یا ۱:۱۰۰ برسد. در حدود ۲۰ چرخه ابتداییPCR محصول دو رشته‌ای به‌صورت فاز نمایی تولید می‌گردد. اما پس از ۲۰ چرخه كه غلظت پرایمر كمتر در واكنش قابل‌چشم‌پوشی است و به‌عبارت‌دیگر، به دلیل تمام شدن پرایمر با غلظت كمتر در چرخه‌های بعدی PCR فقط یک‌رشته از الگو به‌صورت خطی تكثیر می‌شود. پس از پایان PCR چند نسخه DNA دو رشته‌ای و تعداد زیادی DNA تک‌رشته‌ای از ژن موردنظر ایجاد خواهد شد . حالت بهینه‌شده این تکنیک که به LATE-PCR معروف است مشکلاتی نظیر کاهش دمای ذوب پرایمر را رفع نموده است.

PCR نامتقارن ( Asymmetric PCR)

چندشکلی مبتنی بر تکثیر تصادفی DNA یا RAPD-PCR
این روش تحت عنوان PCR با پرایمرهای اختیاری نیز نامیده می‌شود. در این روش از چندین پرایمر چند نوكلئوئیدی كوتاه (۱۲-۸نوكلئوئیدی محتوی ۵۰%GC ) كه به‌طور تصادفی از توالی‌های بازی انتخاب‌شده است، استفاده می‌شود. مهم‌ترین مزیت این روش، عدم نیاز به داشتن توالی ژنومی تحت بررسی است.
RAPD-PCR بر اساس تكثیر تصادفی در دمای پایین انجام و نواحی مختلف ژنومی به‌طور هم‌زمان در یك واكنش PCR تكثیر می‌باشند. چرخه‌های ابتدایی باید دردمای پایین°C50- ° ۳۷ معمولاً برای ۵چرخه اولیه انجام شود تا پرایمرها به‌جایگاه‌های تصادفی در داخل ژنوم متصل گردند. سپس دما افزایش می‌یابد (تا°۵۵)،واكنش برای ۳۵-۳۰ چرخه دیگر ادامه می‌یابد، درواقع تنها جایگاه‌های مناسب‌تر از بین جایگاه‌های تصادفی اولیه تکثیر خواهند شد. البته اگر مكان‌های اتصال پرایمر روی دو رشته الگو در فاصله مناسبی قرارگرفته باشند و جهت‌گیری مناسبی نیز نسبت به هم داشته باشند،DNA پلیمراز قادر به طی كردن فاصله بین ۲ پرایمر اتصال یافته خواهد بود. با بهینه‌سازی دقیق می‌توان در حدود ۵۰ تا ۱۰۰ قطعه DNA مختلف به دست آورد. این چندشکلی‌ها یا از اختلافات موجود در توالی DNAدر مكان‌های اتصال پرایمر یا از دگرگونی‌هایی كه در اثر اضافه شدن، حذف و واژگونی در نواحی تکثیرشده روی‌داده است، منشاء می‌گیرد. باندهای مشاهده‌شده بازتابی از ساختمان كل مولكول DNA استفاده‌شده به‌عنوان الگو می‌باشند.

این روش تكنیكی عالی در علم تبارشناسی می‌باشد، انتظارمی‌رود كه دو موجود زنده خویشاوند دارای الگوی باندی مشابه تری نسبت به دو موجودی باشند كه از نظرتكاملی دورتر هستند. همچنین می‌توان با کمک آن نشانگرهای DNA را توسعه داد. این تکنیک، روشی سریع برای انگشت‌نگاری ژنومی می‌باشد و انگشت‌نگاری ژنومی در تحقیقات جنایی، جرم‌شناسی، پزشكی قانونی درتعیین والدین و روابط پدر فرزندی و تعیین روابط خویشاوندی نقش تعیین‌کننده دارد.

چندشکلی مبتنی بر تکثیر تصادفی DNA یا RAPD-PCR

PCR لانه‌ای (Nested PCR)
روشی برای افزایش حساسیت ، دقت و همچنین بهبود کمی PCR محسوب می‌شود و جداسازی محصول اختصاصی موردنظر را از بین انبوه محصولات غیراختصاصی میسر می‌سازد .
در این روش از دوجفت پرایمراستفاده می‌شود به‌طوری‌که جفت دوم در بین محصول جفت اول جای می‌گیرد. ابتدا جفت پرایمراول(پرایمربیرونی) اضافه‌شده و باعث تكثیر قطعاتی از DNA می‌شود كه احتمالاً تعدادی از آن‌ها محصولات غیراختصاصی‌اند. محصول PCR واكنش اول به‌عنوان DNA الگو برای PCR دوم در حضور پرایمرهای داخلی(پرایمردوم) كه مكمل قسمت داخلی‌تر قطعه DNAموردنظر است مورداستفاده قرار می‌گیرند (شکل۷). احتمال بسیار ضعیفی وجود دارد كه محصولات غیراختصاصی برای جفت پرایمرداخلی اختصاصی دیگر نیز دارای محل شناسایی باشند که این امر باعث افزایش نسبت محصول واقعی به محصول غیراختصاصی خواهد شد. اگر طراحی ۲ پرایمر داخلی به دلیل عدم دسترسی به‌توالی كامل ممكن نباشد می‌توان با استفاده از توالی پرایمر اولیه با افزودن ۲ یا ۳ نوكلئوتید به انتهای ´۳ ، پرایمردوم را طراحی كرد. باوجوداینکه پرایمرهای داخلی همپوشانی قابل‌توجهی با پرایمرهای اولیه دارند اما باعث تكثیراختصاصی توالی هدف وحذف محصولات غیراختصاصی می‌شوند. البته در این حالت نباید از آنزیم‌های دارای فعالیت تصحیح کنندگی ´۳ اگزونوكلئازی استفاده كرد تا انتهای ´۳ تعیین‌کننده حفظ شود.
قابل‌ذکر است تکنیک فوق به‌عنوان روش تشخیصی در بیماری‌هایی نظیر مالاریا ، هپاتیت C ، آنسفالیت مورداستفاده قرار می‌گیرد.

PCR لانه‌ای (Nested PCR)
در این روش هدف تكثیر قطعه‌ای ازDNA است كه هیچ اطلاعی در مورد توالی انتهای آن در دست نیست، ولی در عوض توالی قسمتی از یك ناحیه درونی آن در دست است.
بدین منظور، DNAژنومی با یك آنزیم برشی مناسب هضم می‌شود و سپس انتهاهای چسبنده به هم متصل می‌شوند تا قطعات DNAحلقوی حاصل یابد. بعد از حلقوی شدن، توالی هدف شناخته‌شده با یك آنزیم برشی دیگرهضم می‌شود كه این امر باعث قرارگیری نواحی ناشناخته بین دو ناحیه شناخته‌شده حاصل از هضم آنزیمی می‌شود. حال با طراحی پرایمرمناسب برای توالی شناخته‌شده می‌توان نواحی ناشناخته را تكثیر كرد.
این روش برای شناسایی جایگاه‌های الحاق ویروس‌ها و ترانسپوزونهایی كه به‌طور تصادفی در ژنوم ادغام می‌شوند، مفید است. به‌عنوان‌مثال،‌ توالی‌های قرارگرفته در جایگاه الحاق عناصر IS1 موجود در ژنوم باکتری اشرشیا کولی ، با کمک تکنیک فوق شناسایی گردید.

PCR معکوس( Inverse PCR) 

 

PCR چندگانه (Multiplex PCR)
در این تكنیك از چندین جفت پرایمر اختصاصی در یك محلول PCR جهت تكثیر چندین توالی هدف در یک‌زمان استفاده می‌شود. بنابراین می‌توان با آزمایشات كمتر و زمان كوتاه‌تر اطلاعات بیشتری جمع‌آوری كرد.

اشکال مختلف PCRچندگانه به شرح ذیل است:
۱) واكنش PCR با یك الگو: كه در این روش یك DNA الگو در طولش با چندین جفت پرایمر جهت تكثیر نواحی مخصوص جفت می‌شود. با توجه به اینكه محصولات به‌دست‌آمده اندازه متفاوتی دارند، بخش‌های مختلفی از DNA هدف، جهت شناسایی تغییرات قابل‌بررسی است.
۲) واكنش PCR با چند الگو: در میكروب شناسی بالینی با استفاده از این روش در عفونت‌های مخلوط امكان شناسایی چندین عامل بیماری در یك نمونه بطورهمزمان وجود دارد. با کمک پرایمرهای مختلف و ویژه به جستجوی عوامل مختلف پرداخته می‌شود تا منشاء عامل بیماری‌زا شناسایی گردد.
قابل ذکر است چون در این تكنیك‌ها از چندین پرایمراستفاده می‌شود رعایت نكات زیرضروری است:
۱٫ پرایمرها باید به‌گونه‌ای طراحی گردند كه دمای ذوب (Tm) یكسانی داشته باشند و یا اختلاف دمای ذوب پرایمرها بیش از °۳ تا ۵ درجه نباشد.
۲٫ اختصاصیت پرایمرهای طراحی‌شده برای توالی هدف مهم است.
۳٫ پرایمرهای طراحی‌شده باید برای تشكیل پرایمر دایمر باهمه پرایمرهای حاضر در مخلوط واكنش بررسی شود. چراکه دایمر شدن منجر به تكثیر محصولات غیراختصاصی می‌شود.
به‌طورکلی PCR چندگانه دارای طیف وسیعی از کاربردها نظیر شناسایی عوامل بیماری‌زا، بررسی جهش‌های ایجادشده ( به‌طور مثال در مهندسی ژنوم)، برآورد کمی DNA الگو ، آنالیز پیوستگی ژن‌ها و غیره است.

روش‌های تکثیر هم‌دما
این روش‌ها که در دو دهه اخیر برای تکثیر اسید نوکلئیک توسعه پیدا کرده‌اند؛ تکثیر را در یک دما، با استفاده از پرایمرها، واکنش‌دهنده‌های دیگر و آنزیم‌های موردنیاز به انجام می‌رسانند درنتیجه به دستگاه های ترموسایکلر برای تکثیر نیاز ندارند که درواقع مهم‌ترین مزیت آن‌ها نسبت به PCR محسوب می‌شود، همین طور بسیاری از این تکنیک‌ها به زمان کوتاه تری نسبت به PCR نیاز دارند و همچنین می‌توان در برخی از این روش‌ها تشخیص محصول تولیدشده را به‌طور مستقیم بدون نیاز به شناسایی از طریق الکتروفورز انجام داد که از دیگر مزایای آن‌ها نسبت به واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در نظر گرفته می‌شود. در اینجا به برخی از این تکنیک‌ها اشاره خواهد شد.

تکثیر هم‌دما به واسطه حلقه LAMP
این روش در سال ۲۰۰۰ توسط نوتومی و همکاران ارائه گردید. در این جا برای تکثیر منطقه موردنظر از ژنوم، ۴ یا ۶ پرایمر استفاده می‌شود و تمام مراحل تکثیر در یک دما انجام می‌گیرد بنابراین به دستگاه ترموسایکلر نیازی نیست. برای تشخیص محصول نهایی واکنش نیز می‌توان از روش‌های مختلفی استفاده کرد و حتی می‌توان بدون نیاز به بارگیری نمونه‌ها بر روی ژل آگاروز وجود یا عدم وجود محصول تکثیرشده را تشخیص داد.
اساس تکنیک LAMP
در مرحله آغازین واکنش LAMP هر چهار پرایمر استفاده می‌شوند اما بعد از آن در طول واکنش‌های چرخه‌ای تنها پرایمرهای داخلی برای تکثیر DNA استفاده می‌شوند. پرایمرهای داخلی، FIP یا پرایمر پیش رو داخلی و BIP یا پرایمر پس رو داخلی نامیده می‌شوند و هرکدام دارای دو توالی مشخص در ارتباط با توالی های معنی و ضد معنی ، DNA هدف می‌باشند که یکی برای آغازگری در مرحله اول و دیگری برای خودآغازی در مراحل بعدی مورداستفاده قرار می‌گیرد. برای سهولت بیان توالی های انتهایی منطقه هدف تکثیر DNA ( به‌طورمعمول ۲۳ تا ۲۴ نوکلئوتید) به نام های F2c و B2 نامگذاری می‌شوند. دو توالی داخلی ( معمولاً ۲۳ تا ۲۴ نوکلئوتید)، به نام های F1c و B1 در فاصله ۴۰ نوکلئوتیدی از انتهاهای F2c و B2 در نظر گرفته می‌شوند. همچنین دو توالی ۱۷ تا ۲۱ نوکلئوتیدی خارج از انتهاهای F2c و B2 به نام های F3c و B3 در نظر گرفته می‌شوند. توالی های پرایمرهای FIP و BIP به این صورت طراحی می‌شوند: FIP شامل F1c، فاصله انداز TTTT و توالی F2 (مکمل F2c) می‌باشد. BIP شامل توالی B1c (مکمل B1) ، فاصله انداز TTTT و B2 می‌باشد. دو پرایمر خارجی به ترتیب شامل B3 و توالی F3 مکمل با F3c هستند.
برای انجام واکنش، ابتدا DNA نمونه حاوی توالی هدف موردنظر و چهار پرایمر با گرما واسرشته می‌شوند و سپس به سرعت بر روی یخ قرار می‌گیرند. در ادامه واکنش به‌وسیله اضافه شدن DNA پلیمرازی به نام Bst DNApolymerase آغاز می‌شود و به مدت یک ساعت در ۶۵ درجه سانتی‌گراد واکنش ادامه می‌یابد.
مراحل واکنش در شکل ۱۰ نشان داده‌شده است. پرایمر داخلی FIP با F2c در DNA هدف هیبرید می‌شود و ساخته‌شدن رشته مکمل آغاز می‌شود . پرایمر خارجی F3 که کوتاه‌تر بوده و غلظت پایین‌تری نسبت به FIP دارد به‌صورت آهسته با F3c در DNA هدف هیبرید می‌شود و سنتز DNA با جابجایی رشته آغاز می‌شود. رها شدن رشته مکمل متصل به FIP می‌تواند ساختار حلقه خارج یک ساختار DNA ای ساقه – حلقه شکاف دار حد واسط با نسخه واژگون اضافی از توالی هدف در ساقه و حلقه تشکیل‌شده در انتهای مقابل از طریق توالی BIP تولید می‌شود . در پی سنتز DNA با جابجایی رشته خود آغازگر، یک ساختار مکمل از DNA ساقه – حلقه اصلی و یک ساقه – حلقه DNA با شکاف ترمیم شده به همراه ساقه طویل شده به‌اندازه دو برابر ( نسخه‌های دو برابر شده از توالی هدف) و حلقه در انتهای مقابل ، ایجاد می‌شود. سپس هر دو محصول به‌عنوان الگو برای واکنش جابجایی رشته آغاز شده توسط BIP در چرخه‌های بعدی به کار گرفته می‌شوند.

در واکنش LAMP توالی هدف در هر نیم چرخه سه بار تکثیر می‌شود. محصول نهایی شامل مخلوطی از DNA های ساقه – حلقه با طول ساقه متفاوت و ساختارهای شبیه گل کلم با حلقه‌های متعدد می‌باشد. این حلقه‌ها به‌وسیله ارتباط بین تکرارهای واژگون متناوب توالی هدف در همان رشته‌ایجاد می‌شوند.

استفاده از ۴ پرایمر در مراحل آغازین واکنش LAMP و ۲ پرایمر در طول مراحل بعدی، منحصربه‌فرد بودن را برای تکثیر توالی هدف با استفاده از این روش تضمین می‌کند. به‌علاوه در LAMP، ۴ پرایمر به‌طور هم‌زمان برای آغاز سنتز DNA و شناسایی توالی هدف مورداستفاده قرار می‌گیرد که باعث می‌شود انتخاب توالی هدف نسبت به PCR با اختصاصیت بیشتری صورت پذیرد.ی را در یک انتها شکل دهد. این DNA تک رشته به‌عنوان الگو برای آغاز ساخته‌شدن DNA با پرایمر BIP بکار می‌رود. متعاقباً این DNA تک رشته سنتز DNA با جابجایی رشته آغازشده به‌وسیله B3 صورت می‌گیرد و درنهایت منجر به شکل‌گیری ساختار DNA دمبلی مانند می‌شود. این ساختار به‌سرعت به‌وسیله سنتز DNA خود آغازگر به ساختار DNA ساقه – حلقه تغییر شکل می‌دهد . ساختار ساقه – حلقه DNA، به‌عنوان عامل شروع‌کننده برای چرخه‌های LAMP ( مراحل تکثیر پی‌درپی ) به کار گرفته می‌شود. برای شروع انجام چرخه‌ای واکنش LAMP، FIP با ساختار حلقه در ساقه – حلقه DNA هیبرید شده و سنتز DNA با جابجایی رشته آغاز می‌شود. سپس

محصول واکنش LAMP تعدادی باند با اندازه‌های مختلف از ۳۰۰ جفت باز تا اندازه‌های بزرگ‌تر است بطوریکه بزرگ‌ترین باند ها در نزدیکی چاهک بارگیری نمونه‌ها در ژل آگاروز قرار می‌گیرند.

بهینه‌سازی شرایط برای انجام واکنش LAMP
ازآنجاکه هیبریداسیون ۴ پرایمر در مرحله آغاز برای کارایی بالای واکنش LAMP ضروری است، بنابراین محتوای توالی و اندازه آن‌ها بسیار مهم است. همچنین دمای ذوب (Tm) آن‌ها باید در محدوده خاصی باشد. توالی‌های F2 و B2 در FIP و BIP طوری باید انتخاب شوند که Tm آن‌ها بین ۶۰ تا ۶۵ درجه سانتی‌گراد قرار گیرند. دلیل آن به دمای بهینه فعالیت آنزیم Bst polymerase برمی‌گردد. Tm پرایمرهای F1c و B1c اندکی بالاتر از F2 و B2 در نظر گرفته می‌شود. به این منظور که ساختار حلقه بیرون افتاده، فوراً بعد از آزاد شدن DNA تک رشته از الگو تشکیل شود. به‌علاوه Tm پرایمرهای خارجی ( F3 و B3) پایین‌تر از F2 و B2 لحاظ می‌شود تا واکنش‌های سنتزی مربوط به پرایمرهای داخلی نسبت به پرایمرهای خارجی زودتر رخ دهد. همچنین غلظت پرایمرهای خارجی ۴/۱ تا ۱۰/۱ غلظت پرایمرهای داخلی در نظر گرفته می‌شود. تشکیل ساختار ساقه – حلقه از ساختار دمبل مانند برای انجام چرخه‌های واکنش LAMP حیاتی است. بعلاوه اندازه حلقه در حدفاصل بین F2c ( B2c) و F1c ( B1c) بر کارایی تکثیر تأثیرگذار بوده و در بهترین حالت اندازه آن ۴۰ باز می‌باشد. طول قطعه DNA هدف نیز در انجام صحیح تکنیک LAMP مؤثر است. مطابق بررسی های انجام‌شده مناسب‌ترین طول برای DNA هدف ۱۳۰ تا ۲۰۰ جفت باز می‌باشد. توالی‌های با طول بالاتر از ۵۰۰ جفت باز بسیار ضعیف تکثیر می‌شوند. مناسب‌ترین پلیمراز برای این تکنیک Bst polymerase می‌باشد.

تکثیر هم‌دما به واسطه حلقه LAMP تصویر ژل الکتروفورز نمونه تکثیرشده با استفاده از تکنیک LAMP. به ترتیب از چپ به راست: چاهک اول مارکر DNA 100 جفت بازی، چاهک دوم نمونه تکثیرشده توسط روش LAMP و چاهک سوم کنترل منفی.

حساسیت واکنش LAMP
واکنش LAMP ازنظر حساسیت، دقیق بوده و می‌تواند ۶ نسخه از DNA هدف را در مخلوط واکنش شناسایی کند. درواقع، استفاده از پرایمرهای داخلی (بدون پرایمرهای خارجی) باعث می‌شود که ساختار حلقه بیرون افتاده ساخته نشود و درنتیجه تکثیر نیز انجام نشود. در غیاب یکی از پرایمرهای خارجی نیز تکثیر قابل ملاحظه‌ای صورت نمی‌گیرد. این خود بیانگر ضرورت شناسایی هر ۶ منطقه در DNA هدف برای انجام واکنش LAMP می‌باشد.

استفاده از LAMP برای RNA هدف
واکنش LAMP بر روی سوبسترای RNA نیز مورداستفاده قرار می‌گیرد. در این حالت از آنزیم نسخه‌بردار معکوس همراه با Bst polymerase استفاده می‌شود و از آن با عنوان LAMP جفت شده با نسخه‌برداری معکوس نام می‌برند.

مزایای LAMP
در گزارشات علمی اخیر از تکنیک LAMP به‌عنوان یک روش قوی و مناسب نام‌برده شده است. این تکنیک دارای مزایایی به شرح زیر می‌باشد:
۱٫ این تکنیک، DNA را با کارایی بالا و تحت شرایط هم‌دما تکثیر می‌کند و توانایی شناسایی توالی هدف در مقادیر پایین را دارد. درواقع از این نظر با PCR قابل‌مقایسه است.
۲٫ ازآنجاکه محصول LAMP مخلوطی از DNA های ساقه – حلقه با اندازه‌های مختلف ساقه و ساختارهای گل کلمی با حلقه‌های متعدد می‌باشد در مراحل بعدی می‌توان روش‌های ساده، آسان و انتخابی مطمئنی را برای شناسایی محصول آن‌ها به کار برد.
۳٫LAMP برای توالی هدف، حساسیت و اختصاصیت بالایی دارد. ازآنجاکه در مرحله آغازین شناسایی ۶ ناحیه مستقل به‌وسیله ۴ پرایمر و شناسایی ۴ منطقه در مراحل بعدی انجام می‌گیرد، اختصاصیت بالا می‌رود.
۴٫ برای اجرای تکثیر DNA توسط تکنیک LAMP، به تجهیزات خاص و پیچیده آزمایشگاهی نیاز نیست و تنها به ۴ پرایمر، DNA polymerase و حمام بخار برای انجام واکنش نیاز دارد.

روش تکثیر باواسطه تغییر مکان رشته یا SDA
در این تکنیک برای تکثیر منطقه موردنظر از ژنوم، از قطعه کلنو( DNA polymerase باکتریایی)، آنزیم محدودکننده HincII و dATP تغییریافته‌ای به نام ۲’- deoxyadenosine 5’- O – (۱-thiotriphosphate) یا dATP (αS) استفاده می‌شود. در این تکنیک ابتدا DNA هدف در حضور پرایمرها و دیگر مواد موردنیاز برای آزمایش واسرشته می‌شود. سپس آنزیم HincII و کلنو پلیمراز که خاصیت اگزونوکلئازی ندارد به محلول اضافه می‌شوند. درنهایت این مخلوط واکنش به دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد منتقل‌شده تا تکثیر صورت گیرد.

اساس تکنیک SDA
در ابتدا نمونه DNA هدف با استفاده از گرما واسرشته می‌شود. ۴ پرایمر ( B1، B2، S1 و S2) که به مقادیر اضافی در محیط حضور دارند به رشته‌های هدف در اطراف توالی هدف که باید تکثیر شود، متصل می‌شوند . پرایمرهای S1 و S2 دارای توالی شناسایی آنزیم HincII در ۵’ خود هستند. هر چهار پرایمر به‌وسیله exo- klenow ( klenow polymerase بخش بزرگ از DNA polymerase I باکتریایی) و با استفاده از دئوکسی نوکلئوتیدهای چهارگانه ( dGTP، dCTP، dTTP و dATP(αS)) به‌طور هم‌زمان شروع به تکثیر توالی موردنظر می‌کنند. تکثیر B1 باعث جابجایی محصول تولیدشده توسط S1 ( S1 – ext) می‌شود. همچنین تکثیر B2 باعث جابجایی محصول S2 – ext می‌شود. پرایمرهای B2 و S2 به رشته S1 – ext جداشده متصل می‌شوند. پرایمرهای B1 و S1 نیز به رشته S2 – ext جداشده متصل می‌گردند . واکنش‌های تکثیر و جابجایی بر روی الگوهای S1 – ext و S2 – ext دو قطعه با جایگاه HincII hemiphosphorothioate ( جایگاه شناسایی hemiphosphorothioate باعث می‌شود که در هنگام برش توسط آنزیم محدودکننده تنها یکی از دو رشته DNA یعنی رشته تغییرنیافته دچار شکاف شود و رشته دیگر بدون تغییر باقی بماند) در هر دو انتها و دو قطعه طولانی‌تر با همین جایگاه تنها در یک انتها ایجاد می‌کند. ایجاد شکاف توسط HincII و واکنش‌های جابجایی/تکثیر exo- klenow در هر چهار قطعه آغاز می‌شود و واکنش به‌طور خودبه‌خودی وارد چرخه SDA می‌شود. این مراحل به‌صورت چرخه‌ای و پیوسته انجام و در حین این مرحله، تکثیر ادامه می‌یابند. قطعه‌های حاصل از این مراحل به‌صورت T1:T2 نامگذاری می‌شوند. سپس با استفاده از مقادیر اضافی از دو پرایمر S1 و S2 مراحل تکثیر ادامه می‌یابد. انتهای ۳’، S1 به انتهای ۳’ رشته هدف جابه‌جا شده T1 متصل می‌شود و یک دوپلکس با ۵’ بیرون افتاده ایجاد می‌شود. همچنین S2 به T2 به همین ترتیب متصل می‌شود. ۵’ بیرون افتاده S1 و S2 دارای جایگاه شناسایی برش HincII می‌باشند. قطعه Klenow بدون فعالیت اگزونوکلئازی انتهای ۳’ دوپلکس ها را با استفاده از دئوکسی نوکلئوتید های چهارگانه ( dGTP، dCTP، dTTP و dATP(αS)) تکثیر می‌کند. این تکثیر منجر به تولید جایگاه برش hemiphosphorothioate بر روی S1:T1 و S2:T2 می‌شود. آنزیم HincII بر روی رشته‌های پرایمر تغییرنیافته (حاوی dATP طبیعی) در جایگاه‌های شناسایی hemiphosphorothioate شکاف ایجاد نموده و رشته مکمل تغییریافته (حاوی dATPαS) کامل را خارج می‌کند. قطعه کلنو انتهای ۳’ را در شکاف موجود در S1:T1 تکثیر کرده و رشته پایین‌دستی که مشابه به T2 می‌باشد، جابجا می‌شود. همچنین تکثیر در شکاف ایجادشده بر روی S2:T2 نیز منجر به جابجایی T1 می‌شود. مراحل ایجاد شکاف و پلی مریزاسیون/جابجایی به‌صورت چرخه‌ای و پیوسته بر روی S1:T1 و S2:T2 رخ می‌دهد. تکثیر توالی هدف به‌صورت نمایی خواهد بود چون رشته‌های جابه‌جاشده از S1:T1 به‌عنوان هدف برای S2 به کار گرفته می‌شوند. همچنین رشته‌های جابه‌جا شده از S2:T2 نیز به‌عنوان هدف برای S1 به خدمت گرفته می‌شوند.

اساس تکنیک SDA تکثیر وابسته به هلیکاز ( HDA)
در ارگانیسم‌های زنده DNA هلیکاز برای جداسازی دو رشته DNA مکمل در طول مرحله همانندسازی به کار می‌رود. تکنیک HDA یکی از روش‌های تکثیر هم‌دمای DNA می‌باشد که در آن از فرایند طبیعی موجود در خلقت تقلیدشده است. در این روش از هلیکاز برای واسرشته نمودن DNA دو رشته‌ای استفاده می‌شود تا الگوهای تک‌رشته‌ای برای اتصال پرایمرها به وجود آمده و متعاقب آن تکثیر رخ دهد. ازآنجاکه هلیکاز در یک واکنش آنزیمی DNA دو رشته‌ای را باز می‌کند، به افزایش دمای اولیه و سپس مراحل چرخه‌ای تغییر دما مشابه آنچه که در PCR وجود دارد، نیازی نیست.

اساس تکنیک HDA
اصول کلی تکنیک HDA در شکل ۱۳ نشان داده‌شده است. در این تکنیک DNA های دو رشته‌ای به‌وسیله هلیکاز از یکدیگر جداشده و به‌وسیله پروتئین‌های متصل شونده به DNA تک‌رشته‌ای ( ( SSBs پوشیده می‌شوند. در مرحله بعد دو پرایمر با توالی ویژه به دو انتهای منطقه‌ای از DNA که قرار است تکثیر شود متصل می‌شوند . DNA پلیمرازها از پرایمرهای متصل شده به الگو برای تکثیر قطعه کامل DNA دو رشته‌ای استفاده می‌کنند. پس‌ازآن دو محصول DNA دو رشته‌ای تولیدشده به‌عنوان پیش ماده برای هلیکاز مورداستفاده قرارگرفته و چرخه بعدی واکنش آغاز می‌شود . بنابراین انجام این چرخه‌ها به‌صورت پی‌درپی منجر به تکثیر نمایی توالی هدف خواهد شد.

تکثیر وابسته به هلیکاز

مزایای تکنیک HDA
۱٫ ساده بودن اصول کلی واکنش به‌طوری‌که با دو پرایمر ساده و آنزیم هلیکاز واکنش تکثیر صورت می‌گیرد و نسبت به دیگر تکنیک‌های هم‌دما طراحی ساده‌تری دارد.
۲٫ این تکنیک به معنای واقعی تک دما می‌باشد چون باز شدن دو رشته DNA اولیه به‌وسیله هلیکاز رخ می‌دهد، نیازی به افزایش دمای اولیه وجود ندارد.

بهینه‌سازی مراحل تکنیک HDA
به‌منظور بهینه‌سازی فرایند HDA سه مرحله باز شدن دو رشته DNA، اتصال پرایمر و تکثیر بایستی با یکدیگر هماهنگ باشند. یکی از این موارد، هماهنگی بین هلیکاز و DNA پلیمراز می‌باشد. در این واکنش معمولاً از قطعه کلنو فاقد فعالیت اگزونوکلئازی استفاده می‌شود. برای رسیدن به بهترین حالت می‌توان از آنزیم‌های هلیکاز و پلیمرازهایی که به‌طور طبیعی با یکدیگر فعالیت می‌کنند استفاده کرد ( مثل DNA polymerase III و DnaB helicase). مرحله دیگری که برای انجام مناسب فرایند می‌تواند بهینه شود، برهمکنش بین SSB و DNA می‌باشد. غلظت پروتئین‌های مورداستفاده در واکنش نیز بر میزان نهایی محصول تأثیرگذار می‌باشد.

تکثیر با جابجایی رشته چندگانه هم‌دما ( IMDA)
این تکنیک برای تکثیر DNA از پرایمرهای چندگانه و DNA پلیمراز ۲۹Φ که دارای ثبات بالایی است و حداقل ۷۰۰۰۰ نوکلئوتید را به‌صورت پیوسته همانندسازی می‌کند و سنتز با جابجایی رشته را با نرخ ۲۵ تا ۵۰ نوکلئوتید در هر ثانیه انجام می‌دهد، استفاده می‌کند.

اساس تکنیک IMDA
در این تکنیک دو مجموعه پرایمری به نام‌های مجموعه راست و مجموعه چپ استفاده می‌شوند. پرایمرهای مجموعه راست مکمل یکی از رشته‌های DNA می‌باشند و پرایمرهای مجموعه چپ مکمل با رشته دیگر DNA هستند. زمانی که پرایمرهای هر دو مجموعه برای تکثیر با مولکول DNA هیبرید می‌شوند، به حالتی است که انتهای ۵’ این پرایمرها در مکان دورتر نسبت به‌توالی موردنظر ما قرار گیرند. تکثیر به‌وسیله Φ ۲۹ DNA polymerase در هر پرایمر آغازشده و به سمت توالی موردنظر ادامه پیدا می‌کند. در حین فرایند تکثیر، رشته‌های ساخته‌شده میانی توسط پلیمراز جابجا می‌شوند. بدین معنی که به‌طور هم‌زمان که پرایمرهای جدید گسترده می‌شوند، محصول تولیدشده قبلی جابجا می‌شود. ویژگی دیگر واکنش IMDA این است که پرایمرها به‌وسیله اتصال‌های فسفوروتیوات در ۲ نوکلئوتید انتهایی پایانه ۳’ محافظت می‌شوند این کار برای جلوگیری از فعالیت اگزونوکلئازی ۳’ به ۵’ پلیمراز به‌منظور اصلاح و درنتیجه تخریب پرایمرها، ضروری می‌باشد. در این تکنیک پس از مرحله واسرشته شدن اولیه DNA، که در آن دو رشته DNA از یکدیگر جدا می‌شوند مابقی مراحل در ۳۰ درجه سانتی‌گراد انجام می‌گیرد. ضمناً از این تکنیک برای تکثیر کل ژنوم با استفاده از چندین پرایمر عمومی نیز استفاده می‌شود.

تکثیر با جابجایی رشته چندگانه هم‌دما ( IMDA)

تکثیر حلقه چرخان یا RCA
این تکنیک برای تکثیر DNA حلقوی بکار می‌رود. در این روش از DNA پلیمراز فاژ Φ۲۹ که دارای ثبات بالایی بوده و همچنین تکثیر با جابجایی رشته را به‌خوبی انجام می‌دهد استفاده می‌شود. این تکنیک برای تکثیر DNA حلقوی ویروس‌ها و فاژها در موارد تشخیصی مناسب می‌باشد. از پروب های Padlock برای حلقه‌ای کردن DNA خطی استفاده می‌شود. بنابراین می‌توان DNA خطی را نیز به این شیوه تکثیر نمود. در این تکنیک می‌توان از یک، دو یا چند پرایمر برای تکثیر استفاده کرد.

اساس تکنیک RCA
در این تکنیک بعد از مرحله واسرشته سازی اولیه پرایمرها، dNTP، بافر و Φ۲۹ DNA polymerase به مولکول‌های DNA واسرشته شده اضافه می‌شوند. بعد از اتصال پرایمر تخصصی به مولکول الگو، پلیمراز شروع به‌اضافه کردن نوکلئوتید ها در مقابل رشته الگو می‌کند. زمانی که پلیمراز به مکان اولیه رسید با استفاده از خاصیت جابجایی رشته، دوباره شروع به سنتز از روی رشته الگو نموده و رشته جدید تازه سنتز شده جایگزین رشته قدیمی می‌شود. این فرایند با توجه به طول رشته الگو تکرار می‌شود تا زمانی که فاکتور های خارجی مثل تمام شدن نوکلئوتید ها باعث توقف واکنش شوند . این مراحل در دمای ۳۰ درجه سانتی‌گراد رخ می‌دهند و زمان آن به‌اندازه مولکول الگو وابسته است. در پایان واکنش از روی مولکول اولیه نسخه‌های زیادی ساخته می‌شود ( مولکول اولیه با طول حدود ۱۵۰ جفت باز تقریبأ ۱۰۷ برابر تکثیر می‌شود). در تکثیر DNA حلقوی ویروس‌های ناشناخته از چندین پرایمر با توالی تصادفی برای تکثیر استفاده می‌شود.

تکثیر حلقه چرخان یا RCAشکل بالا نمای تکنیک RCA است. قسمت بالا: الگوی حلقوی و یک پرایمر. آغاز سنتز از انتهای پرایمر متصل شده شروع می‌شود. پس از یک دور کامل پرایمر و DNA ساخته‌شده متصل به آن جابجا شده و سنتز برای دورهای بعدی ادامه پیدا می‌کند. به این وسیله قطعات DNA تک‌رشته‌ای متصل‌به‌هم و طویلی تولید می‌شوند. قسمت پایین: مولکول حلقوی و پرایمرهای تصادفی چندگانه. سنتز در مکان پرایمرهای چندگانه متصل شده به DNA الگو آغاز می‌شود. سنتز با جابجایی رشته همانند شکل بالایی اتفاق می‌افتد.

 استفاده از دو پرایمر در تکنیک RCA.استفاده از دو پرایمر در تکنیک RCA. پرایمر ۱ (P1) شروع‌کننده واکنش بوده و پرایمر دوم (P2) به قطعه‌های حاصل از تکثیر اولیه توسط P1 متصل می‌شوند. چندین پرایمر P2 به قطعه‌های تکراری حاصل از تکثیر اولیه متصل می‌شوند و تکثیر از انتهاهای پرایمرهای P2 نیز آغاز می‌شود و زمانی که تکثیر در انتهای یک پرایمر به پرایمر دوم رسید جابجایی رشته رخ می‌دهد و هم‌زمان در رشته‌های حاصل از پرایمر P2 مکان‌های اتصال برای پرایمر P1 نیز فراهم می‌شود. زمانی که پرایمر P2 به تکرار پنجم متصل می‌شود، پرایمر متصل به تکرار سوم شروع به جابجایی و ایجاد شاخه می‌کند. متعاقباً زمانی که P2 به تکرار هفتم متصل می‌شود رشته ساخته‌شده در تکرار پنجم شروع به جابجایی کرده و شاخه ایجاد می‌کند و به همین ترتیب ادامه پیدا می‌کند. زمانی که P2 به تکرار دهم متصل می‌شود DNA دارای سه‌شاخه رشد کرده می‌باشد. اتصال پرایمرهای جدید به رشته DNA های آزادشده نیز به وقوع می‌پیوندد و در آن‌ها نیز شاخه ایجاد می‌شود . این وضعیت در قسمت پایین شکل نشان داده‌شده است. رشته‌های DNA ساخته‌شده از انتهای P2 دارای مکان اتصال برای P1 می‌باشند. بنابراین قطعه‌های DNA ایجادشده کاملأ دو رشته‌ای خواهند بود. درنهایت تعداد زیادی DNA دو رشته‌ای با اندازه‌های مختلف به دست خواهد آمد.

تکثیر پلیمراز- ریکامبیناز ( RPA)
اساس تکنیک RPA اتصال پرایمرهای الیگونوکلئوتیدی به DNA الگو و گسترش آن‌ها همانند PCR می‌باشد. اما به‌جای اینکه از دمای بالا برای واسرشته سازی DNA دو رشته‌ای استفاده شود از کمپلکس نوکلئوپروتئینی تشکیل‌شده از آنزیم ریکامبیناز و پرایمر استفاده می‌گردد. واکنش RPA در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد به‌صورت هم‌دما به مدت تقریبأ ۶۰ دقیقه انجام می‌شود. حساسیت این روش قابل‌مقایسه با PCR بوده و کم‌تر از ۱۰ نسخه از مولکول هدف را می‌تواند شناسایی کند.

اساس تکنیک RPA
در این تکنیک، تکثیر هم‌دمای قطعه خاصی از DNA به‌وسیله اتصال پرایمرهای مربوط به دو انتهای قطعه‌ای که قرار است تکثیر شود و توسعه آن‌ها توسط DNA پلیمراز صورت می‌پذیرد . در مرحله آغازین، واسرشته سازی سراسری مولکول DNA الگو انجام نمی‌شود. بدین دلیل که پرایمرها مستقیماً به‌توالی هدف مکمل خود متصل می‌شوند. به‌این‌ترتیب که کمپلکس‌های پرایمر – ریکامبیناز برای یافتن مناطق هدف بر روی DNA دو رشته‌ای به کار می‌روند و تبادل رشته در جایگاه‌های هومولوگ انجام می‌شود. سپس تک رشته‌های جابجا شده با پروتئین‌های متصل شونده به DNA تک‌رشته‌ای ( SSBP) برهمکنش داده و ساختارهای پایداری ایجاد می‌کنند. درنتیجه آن، از دو رشته‌ای شدن مجدد و پس زده شدن پرایمرها جلوگیری به عمل می‌آید. جدا شدن ریکامبیناز انتهای ۳’ ، الیگونوکلئوتیدها را برای DNA پلیمراز با خاصیت جابجایی رشته مثل Bst قابل‌دسترس کرده و گسترش پرایمرها آغاز می‌شود. تکثیر نمایی به‌وسیله تکرار چرخه‌ای این فرایند به وقوع می‌پیوندد. نکته اساسی در مورد واکنش RPA این است که محیط واکنش پویایی ایجاد شود که تشکیل و تجزیه رشته‌های پرایمر – ریکامبیناز را به تعادل برساند. ریکامبیناز مورداستفاده می‌تواند T4uvsX باشد . این آنزیم در حضور ATP توانایی اتصال به پرایمر را دارد و پس از هیدرولیز ATP کمپلکس به‌طور خود به خودی تجزیه می‌شود. سپس ریکامبیناز جداشده و با SSBP ای مثل T4gp32 جایگزین می‌شود. همچنین مشخص‌شده است که فاکتور T4uvsY به‌عنوان فاکتور بارگیری ریکامبیناز و Carbowax20M (پلی اتیلن گلیکول) در ایجاد شرایط مطلوب برای واکنش مؤثر می‌باشند.

تکثیر پلیمراز- ریکامبیناز ( RPA)
تصویر واکنش RPA و شکل‌گیری رشته‌های ریکامبیناز – پرایمر. بالا) رشته‌های ریکامبیناز – پرایمر DNA الگو را برای یافتن توالی های هومولوگ ( قرمز/آبی) جستجو می‌کنند. بعد از تبادل رشته، رشته‌های جابجا شده به SSBP ها ( سبز) متصل می‌شوند و دو پرایمر توسط Bst پلیمراز گسترده می‌شوند. درنتیجه گسترده شدن دو پرایمر یک نسخه از مولکول الگو اولیه علاوه بر نسخه اولیه تولید می‌شود. تکرار این مراحل منجر به تکثیر نمایی DNA هدف می‌شود. پایین) در حضور ATP، UvsX ( خاکستری ) به الیگونوکلئوتید ها ( قرمز، بالا ) متصل می‌شود. بعد از هیدرولیز ATP، کمپلکس نوکلئوپروتئین تجزیه‌شده (چپ ) و UvsX می‌تواند به‌وسیله SSBPs ( خاکستری، راست ) جایگزین شود. حضور UvsY و Carbowax20M (پلی اتیلن گلیکول) توازن واکنش را به سمت بارگیری مطلوب ریکامبیناز پیش می‌برد.

 

کاربرد تکنیک‌های هم‌دما در تشخیص بیماری‌های عفونی
کشف ساختار DNA، آشکار شدن مکانیسم‌های مولکولی و همچنین ابداع تکنیک PCR روش‌های قدرتمندی را برای تشخیص بیماری‌های ژنتیکی و عفونی فراهم آوردند. باوجوداین پیشرفت‌ها همچنان استاندارد طلایی برای شناسایی میکروب‌ها، کشت و تمایز فنوتیپی عامل بیماری محسوب می‌شد. این فرایندها به‌طورمعمول یک تا پنج روز به طول می‌انجامد، بنابراین درمان مؤثر به تأخیر می‌افتد. این تأخیر بر شیوع بیماری و مرگ‌ومیر تأثیرگذار می‌باشد. تشخیص دقیق عامل بیماری به‌شدت وابسته به زمان می‌باشد. درمان ضد میکروبی نامناسب نیز در عفونت‌های خطرناک نشان داده‌شده است که می‌تواند تا پنج برابر شانس زنده ماندن را کاهش دهد. به‌علاوه روش‌های وابسته به کشت موجود، شناسایی را بر اساس ارگانیسم‌هایی که در محیط کشت رشد می‌کنند، انجام می‌دهند. بنابراین با استفاده از این روش‌های استاندارد طلایی موجود نمی‌توان پاتوژن‌هایی را که در محیط آزمایشگاه قابل‌کشت نیستند را شناسایی کرد. در حالیکه توسط روش‌های مولکولی قابل‌شناسایی‌اند. بنابراین به روش‌های سریع‌تر، حساس‌تر و اختصاصی‌تر برای جایگزینی روش‌های قدیمی‌تر، نیاز جدی احساس می‌شود. با استفاده از روش‌های مولکولی توالی DNA عامل بیماری به‌طور مستقیم موردبررسی قرار می‌گیرد و شناسایی با دقت بالایی انجام می‌شود. برای انجام این کار ابتدا اسید نوکلئیک استخراج‌شده، تکثیر قطعه اختصاصی عامل بیماری انجام‌شده و در مرحله بعد شناسایی قطعه تکثیرشده، رخ می‌دهد. اما می‌توان با استفاده از پروب های فلورسنت و همچنین رنگ‌های متصل شونده به DNA مراحل تکثیر و شناسایی را باهم ترکیب کرد و درنتیجه در زمان صرفه‌جویی بیشتری به عمل آورد. ازجمله روش‌های مولکولی می‌توان به PCR اشاره کرد، اما به دلیل نیاز داشتن به دستگاه ترموسایکلر و همچنین دیگر محدودیت‌ها به‌تازگی تحقیقات به سمت روش‌های هم‌دما سوق پیداکرده است. در بررسی روش‌های هم‌دما می‌توان نکاتی را در نظر گرفت به‌عنوان نمونه به برخی از آن‌ها اشاره می‌شود:
عامل دما: در برخی از این تکنیک‌ها به یک افزایش دمای اولیه برای جداسازی دو رشته DNA از یکدیگر نیاز است مثل SDA و RCA اما در برخی دیگر به این افزایش دمای اولیه هم نیازی نیست به‌عنوان نمونه HDA و RPA. لازم به ذکر است که تقریبأ تمام تکنیک‌های هم‌دما در دمایی حدفاصل ۳۰ تا ۶۵ درجه سانتی‌گراد انجام می‌شوند. دماهای بالاتر می‌تواند تأثیر مثبتی بر اختصاصیت واکنش داشته باشد، چون از اتصال غیراختصاصی پرایمرها جلوگیری می‌کند.
سادگی انجام آزمایش: در این تکنیک‌ها علاوه بر کاهش هزینه روش انجام تکنیک نیز ساده بوده و در یک میکروتیوپ با حداقل حجم ممکن، واکنش‌دهنده‌های کم و دست‌کاری‌های اندک، انجام می‌پذیرد.
تحمل در برابر نمونه‌های باکیفیت پایین: اکثر تکنیک‌های تشخیصی مولکولی به نمونه‌های اسید نوکلئیک خالص نیاز دارند. عواملی مثل آهن، اوره، لاکتوفرین و … که در نمونه‌های به‌دست‌آمده از خون، ادرار و غیره وجود دارند می‌توانند در واکنش PCR اختلال ایجاد کنند. نشان داده‌شده است که روش‌های هم‌دما در مقابل بسیاری از این بازدارنده‌ها متحمل هستند و واکنش تکثیر به‌خوبی انجام می‌گیرد.

شناسایی محصول واکنش‌های تکثیر
محصول‌های واکنش معمولاً از طریق الکتروفورز بر روی ژل آگاروز یا پلی اکریل آمید به‌وسیله رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید یا نیترات نقره شناسایی می‌شوند. روش‌های دیگری به‌منظور آسان تر و کوتاه‌تر شدن توسعه پیداکرده‌اند که به‌اختصار بیان می‌شوند. به‌عنوان‌مثال می‌توان به دورگه‌سازی محصول‌ها با پروب های هومولوگ، استفاده از آویدین برای جمع‌آوری هیبریدهای حاصل از محصول‌های بیوتینه شده و پروب های نشان‌دار اشاره کرد.
روش دیگر استفاده از پروب های الیگونوکلئوتیدی است که بر روی غشاء های نایلونی تثبیت‌شده‌اند و هیبرید شدن آن‌ها با محصول‌های واکنش بیوتینه شده صورت می‌گیرد. فرآورده‌های حاصل از تکثیر به‌وسیله واکنش رنگ سنجی شناسایی می‌شوند. ظرف‌های میکروتیتر برای جذب محصول‌های واکنش تکثیری که با پروب های DNA ای بیوتینه شده نشان‌دار شده‌اند، بکار می‌روند.
روش دیگر که در آن به هیبریداسیون نیاز نیست، با استفاده از پرایمرهای نشان‌دار شده با فلورسنت و بیوتین انجام می‌پذیرد. محصول‌های تکثیرشده به مهره‌های پوشیده شده از آویدین متصل شده و شدت فلورسنت مستقیمأ بعد از واسرشته شدن محصول‌های دو رشته‌ای محاسبه می‌شود. درروشی دیگر DNA هدف به‌وسیله نوکلئوتید های نشان‌دار تکثیر می‌شود. با استفاده از روش‌های خاص خالص‌سازی DNA محصول‌های نشان‌دار را از نوکلئوتید ها یا الیگونوکلئوتید های نشان‌دار نشده می‌توان جدا کرد. درنتیجه فرآورده‌های تکثیرشده مستقیمأ با استفاده از روش‌های آنزیمی – ایمنی یا آنزیم‌های ملحق شونده به استرپتاویدین قابل‌مشاهده خواهند بود. از یون پیروفسفات آزادشده درنتیجه فعالیت DNA پلیمراز نیز می‌توان برای شناسایی استفاده کرد. به‌نحوی‌که این یون با منیزیوم موجود در واکنش، تولید منیزیوم پیروفسفات می‌کند. در مواردی که مقادیر زیادی از DNA درنهایت تولیدشده و درنتیجه آن مقادیر زیادی پیروفسفات نیز تولید خواهد شد، این یون با یون‌های فلزی گوناگون ترکیب‌شده و نمک‌های غیر محلول را به وجود می‌آورد. این موضوع خود باعث تولید رسوب‌هایی بارنگ‌های خاص می‌شود. به‌عنوان‌مثال منیزیوم پیروفسفات رسوب‌های سفیدرنگ تولید می‌کند. البته سیگنال تولیدشده در این روش نسبتأ ضعیف است. برای تقویت این سیگنال باید غلظت یون منیزیوم را تغییر داد.

print
Tags: , , , , , , , , , , , , ,


دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

1 × 1 =